4. 미생물시험법

미생물학적 검사를 위해서는 반드시 모든 과정이 무균적으로 수행되어야 하며 동시에 시험과정 중의 교차오염을 방지하기 위해 실험실내는 항상 청결을 유지하여야 한다. 시험 시 음성대조군을 사용하여 시험조작의 무균여부를 확인한다.

4.1 일반사항

4.1.1 검체의 채취

가. 검체 채취기구는 미리 핀셋, 시약스푼 등을 몇 개씩 건열 및 화염멸균을 한 다음 검체 1건마다 바꾸어 가면서 사용하여야 한다.

나. 검체가 균질한 상태일 때에는 어느 일부분을 채취하여도 무방하나 불균질한 상태일 때에는 여러 부위에서 일반적으로 많은 양의 검체를 채취하여야 한다.

다. 미생물학적 검사를 하는 검체는 잘 섞어도 균질하게 되지 않을 수 있기 때문에 실제와는 다른 검사 결과를 가져올 경우가 많다.

라. 미생물학적 검사를 위한 검체의 채취는 반드시 무균적으로 행하여야 한다.

마. 미생물 규격이 n, c, m, M으로 표현된 경우, 정하여진 시료수(n) 만큼 검체를 채취하여 각각을 시험한다.

바. 소, 돼지의 도체 표면에서 시료 채취시는 금속, 알루미늄 호일 또는 골판지 등으로 된 시료채취틀이 필요하다. 금속틀을 재사용할 경우 소독수에 담근 후 증류수로 세척 및 건조시켜 사용하고 알루미늄 호일, 골판지 등은 종이로 포장하여 멸균한 후 1회용으로 사용한다.

사. 소 및 돼지 등의 도체는 표면(10 cm × 10 cm)의 3개 부위에서 채취하여 검사하는 것을 원칙으로 하고 부득이한 경우에 1개 부위(흉부표면)에서 채취하여 검사할 수도 있으며, 닭의 도체는 1마리 전체를 세척하여 검사함을 원칙으로 한다.

아. 기타 제반사항은 제7. 검체의 채취 및 취급방법을 참고하여 따른다.

4.1.2 확인시험

가. 균의 확인시험은 국제적으로 공인된 키트(kit) 또는 장비를 이용할 수 있다. 또한, 필요한 경우 혈청형 확인시험, 독소 유전자 확인시험, 유전체 상동성 분석시험을 추가할 수 있다.

1) 혈청형 확인시험：비브리오 혈청형 확인(O1, O139 등), 장출혈성대장균 혈청형 확인(O157, O111, O26 등), 살모넬라 혈청형 확인(Salmonella Enteritidis, S. Typhimurium 등) 등

2)  독소 유전자 확인시험：장출혈성 대장균 (stx1, stx2) 등

3) 유전체 상동성 분석시험：PFGE(Pulsed-Field Gel Electrophoresis) 등

나. 대장균, 대장균군, 식중독균 정량검사 시 계수된 집락수가 규격치 이하일 경우 확인시험(대장균군의 경우 확정시험 및 완전시험, 대장균 최확수법 제2법의 경우 확정시험)을 생략할 수 있다.

다. 발효제품에서 균주 확인이 필요한 경우 차세대염기서열분석기를 활용한 유전체 분석(전장유전체, 메타게놈 등)을 할 수 있다.

라. 식품의약품안전처장이 필요하다고 인정하는 경우에는 식중독균 증균배양 후 PCR 등 분자생물학적 시험법을 활용한 스크리닝 시험을 통하여 불검출로 판정할 수 있다. 다만, 유전자가 확인된 경우 분리배양 후 생화학적 검사 등을 통하여 해당 식중독균으로 동정되면 검출로 판정한다.

4.2. 기구 및 재료

가. 무균대(Clean bench)

나. 고압멸균기(Autoclave)

다. 원심분리기(Centrifuger)

라. 교반기(Stirrer)

마. 건조기(Dry Oven)

바. 배양기(Incubator), CO2 배양기, 혐기배양 Jar

사. 항온수조(Water Bath, 자동온도 조절기능함유)

아. 균질기(Stomacher 또는 Homogenizer)

자. 냉동 및 냉장고(-70℃ Freezer 포함)

차. 초순수 제조장치(Ultra Pure Water System)

카. 집락계산기(Colony Counter)

타. 수소이온농도측정기(pH meter)

파. 피펫(1 mL, 5 mL, 10 mL 등)

하. 시험관(Test Tube, 18×170 mm 등)

거. 발효관(Durham tube, Smith tube)

너. 페트리접시(Petridish)

더. 광학현미경(Optical microscope)

러. 슬라이드/커버 글라스

머. 알콜램프, 백금이, 백금선 등

버. 표준항혈청(대장균, 살모넬라, 리스테리아 등)

서. Guinea pig(250∼300 g), 마우스(12∼15 g)

4.3 시험용액의 제조

가. 미생물검사용 시료는 25 g(mL)을 대상으로 검사함을 원칙으로 한다. 다만 시료량이 적은 불가피한 경우 그 이하의 양으로 검사할 수도 있다.

나. 미생물 정성시험에서 5개 시료를 검사하는 경우, 5개 시료에서 25 g(mL)씩 채취하여 각각 검사한다. 다만, 시료에 직접 증균배지를 가하여 배양하는 경우는 5개 시료에서 25 g(mL)씩 채취하여 섞은(pooling) 125 g(mL)을 검사할 수 있다.

다. 채취한 검체는 희석액을 이용하여 필요에 따라 10배, 100배, 1,000배 등 단계별 희석용액을 만들어 사용할 수 있다. 다만, 제조된 시험용액과 단계별 희석액은 즉시 실험에 사용하여야 한다.

라. 희석액은 멸균생리식염수, 멸균인산완충액 등을 사용할 수 있다. 단, 별도의 시험용액 제조법이 제시되는 경우 그에 따른다.

마. 검체를 용기 포장한 대로 채취할 때에는 그 외부를 물로 씻고 자연 건조시킨 다음 마개 및 그 하부 5～10 cm의 부근까지 70% 알코올탈지면으로 닦고, 멸균한 기구로 개봉, 또는 개관하여 2차 오염을 방지하여야 한다.

바. 지방분이 많은 검체의 경우는 Tween 80과 같은 세균에 독성이 없는 계면활성제를 첨가할 수 있다.

사. 실험을 실시하기 직전에 잘 균질화 하고 검사검체에 따라 다음과 같이 시험용액을 제조한다.

1) 액상검체：채취된 검체를 강하게 진탕하여 혼합한 것을 시험용액으로 한다.

2) 반유동상검체：채취된 검체를 멸균 유리봉 또는 시약스푼 등으로 잘 혼합한 후 그 일정량[10～25 g(mL)]을 멸균용기에 취해 9배 양의 희석액과 혼합한 것을 시험용액으로 한다.

3) 고체검체：채취된 검체의 일정량(10～25 g)을 멸균된 가위와 칼 등으로 잘게 자른 후 희석액을 가해 균질기를 이용해서 가능한 한 저온으로 균질화한다. 여기에 희석액을 가해서 일정량(100～250 mL)으로 한 것을 시험용액으로 한다.

4) 고체표면검체：검체표면의 일정면적(보통 100 cm2)을 일정량(1～5 mL)의 희석액으로 적신 멸균거즈와 면봉 등으로 닦아내어 일정량(10～100 mL)의 희석액을 넣고 강하게 진탕하여 부착균의 현탁액을 조제하여 시험용액으로 한다.

5) 분말상검체：검체를 멸균 유리봉과 멸균 시약스푼 등으로 잘 혼합한 후 그 일정량(10～25 g)을 멸균용기에 취해 9배 양의 희석액과 혼합한 것을 시험용액으로 한다.

6) 버터와 아이스크림류 : 검체 일정량(10∼25g)을 멸균용기에 취해 40℃이하의 온탕에서 15분 내에 용해시킨 후 희석액을 가하여 100∼250mL로 한 것을 시험용액으로 한다.

7) 캡슐제품류：캡슐을 포함하여 검체의 일정량(10～25 g)을 취한 후 9배 양의 희석액을 가해 균질기 등을 이용하여 균질화한 것을 시험용액으로 한다.

8) 냉동식품류 : 냉동상태의 검체를 포장된 상태 그대로 40℃이하에서 될 수 있는대로 단시간에 녹여 용기, 포장의 표면을 70% 알코올솜으로 잘 닦은 후 상기 가.～사.의 방법으로 시험용액을 조제한다.

9) 칼․도마 및 식기류 : 멸균한 탈지면에 희석액을 적셔, 검사하고자 하는 기구의 표면을 완전히 닦아낸 탈지면을 멸균용기에 넣고 적당량의 희석액과 혼합한 것을 시험용액으로 사용한다.

4.4 배지 및 시액

4.4.1 배지

미생물 시험을 위한 배지조제 시 이미 상품화된 배지의 사용이 가능하며, 사용할 경우 각 제조사별 조제법을 따를 수 있다.

1) 표준한천배지(Plate Count Agar)

Tryptone	5.0 g

Yeast Extract	2.5 g

Dextrose	1.0 g

Agar	15.0 g

위의 성분에 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 7.0±0.2로 조정한 후 121℃로 15분간 멸균한다.

2) 유당배지(Lactose Broth)

Peptone	5.0 g

Beef Extract	3.0 g

Lactose	5.0 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 6.9±0.2로 조정한 후 발효관을 넣은 시험관에 10 mL씩 분주하여 121℃에서 15분간 멸균한다.

3) BGLB배지(Brilliant Green Lactose Bile Broth)

Peptone	10.0 g

Lactose	10.0 g

Oxgall	20.0 g

Brilliant green	0.0133 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 7.2±0.1로 조정한 후 발효관을 넣은 시험관에 10 mL씩 분주하여121℃에서 15분간 멸균한다. 필요에 따라 MUG 50 mg을 첨가하여 사용한다(BGLB-MUG).

4) 두배농도 BGLB배지(Brilliant Green Lactose Bile Broth)

Peptone	20.0 g

Lactose	20.0 g

Oxgall	40.0 g

Brilliant green	0.0266 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 7.2±0.1로 조정한 후 발효관을 넣은 시험관에 10 mL씩 분주하여 121℃에서 15분간 멸균한다.

5) Endo 한천배지(Endo Agar)

Peptone	10.0 g

Lactose	10.0 g

Dipotassium Phosphate	3.5 g

Sodium Sulfite	2.5 g

Basic Fuchsin	0.5 g

Agar	15.0 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 7.4±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

6) EMB 한천배지(Eosine Methylene Blue Agar)

Peptone	10.0 g

Lactose	5.0 g

Sucrose	5.0 g

Dipotassium Phosphate	2.0 g

Eosin Y	0.4 g

Methylene Blue	0.065 g

Agar	13.5 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 6.8±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

7) 보통배지(Nutrient Broth)

Peptone	5.0 g

Beef Extract	3.0 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 7.0～7.4로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

8) 보통한천배지(Nutrient Agar)

Peptone	5.0 g

Beef Extract	3.0 g

Agar	15.0 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 6.8±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

9) 데스옥시콜레이트유당한천배지(Desoxycholate Lactose Agar)

Peptone	10.0 g

Lactose	10.0 g

Sodium Chloride	5.0 g

Sodium Citrate	2.0 g

Sodium Desoxycholate	0.5 g

Neutral Red	0.03 g

Agar	15.0 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 7.3～7.5로 조정한 후 1분간 가열한다. 단, 고압증기멸균을 해서는 안 된다.

10) EC 배지(EC Broth)

Peptone	20.0 g

Lactose	5.0 g

Bile Salt Mixture	1.5 g

Dipotassium Phosphate	4.0 g

Monopotassium Phosphate	1.5 g

Sodium Chloride	5.0 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 6.9±0.2로 조정한 후 발효관을 넣은 시험관에 10 mL 씩 분주하여 121℃에서 15분간 멸균한다.

11) BCP첨가 평판측정용 한천배지(Plate Count Agar with Bromocresol Purple)

Peptone	5.0 g

Yeast Extract	2.5 g

Dextrose	1.0 g

Tween 80	1.0 g

L-Cysteine	0.1 g

Bromocresol Purple	0.05 g

Agar	15.0 g

위의 성분(다만, 종균에 따라 적정 peptone을 사용하여야 함)을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 6.8±0.2으로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

12) 포테이토 덱스트로즈 한천배지(Potato Dextrose Agar)

Potato Infusion	200.0 g

Dextrose	20.0 g

Agar	15.0 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 5.6±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균하여 식힌다. 멸균된 10% 주석산을 무균적으로 가하여 pH를 3.5±0.1로 맞추거나 chloramphenicol을 100 ㎍/mL 농도로 첨가한다.

13) 티오글리콜린산염배지(Fluid Thioglycollate Medium)

Yeast Extract	5.0 g

Casitone	15.0 g

Dextrose	5.0 g

Sodium Chloride	2.5 g

L-Cystine	0.75 g

Thioglycolic Acid	0.5 g

Agar	0.75 g

Resazurin	0.001 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH를 7.1±0.2로 조정하고 121℃에서 15분간 멸균한 후 찬물에 급냉하여 레자즈린(resazurin, 붉은색) 층이 나타나게 한다.

14) 난황첨가 만니톨 식염한천배지(Mannitol Salt Agar with Egg Yolk)

Beef Extract	2.5 g

Peptone	10 g

Mannitol	10 g

Sodium Chloride	75 g

Agar	15 g

Phenol Red	0.025 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 가열 용해한 후 pH 7.2～7.6으로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균하고 50℃정도로 식혀 난황액(시액 8)을 10%의 비율로 무균적으로 가해 잘 혼합한 후 사용한다.

15) BL 한천배지(BL Agar)

Beef Extract Liver Extract Yeast Extract Proteose Peptone Tryptone Soypeptone Soluble Starch Glucose Dipotassium Phosphate Monopotassium Phosphate Magnesium Sulfate Sodium Chloride Manganese Sulfate L-Cysteine․HCl․H2O Ferrous Sulfate Polysorbate 80(Tween 80) Agar	3 g 5 g 5 g 10 g 5 g 3 g 0.5 g 10 g 1 g 1 g 0.2 g 0.01 g 0.0067 g 0.5 g 0.01 g 1 g 15 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 7.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균하여, 50℃로 냉각시킨 후 소, 말, 양의 탈 섬유소 혈액을 5% 되도록 첨가한다.

16) Alkaline 펩톤수(Alkaline Peptone Water)

Peptone	10 g

Sodium Chloride	20 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 8.6(당을 포함한 제품의 경우에는 pH 9.2)으로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

17) TCBS 한천배지(Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose Agar)

Yeast Extract	5 g

Peptone	10 g

Sodium Citrate	10 g

Sodium Thiosulfate	10 g

Oxgall	5 g

Sodium Cholate	3 g

Sucrose	20 g

Sodium Chloride	10 g

Ferrous Citrate	1 g

Bromothymol Blue	0.04 g

Thymol Blue	0.04 g

Agar	15 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 8.6으로 조정한 후 가열하여 사용한다. 단, 고압증기멸균을 해서는 안 된다.

18) LIM 반유동배지(Lysine Indole Motility Medium)

Peptone	10 g

Yeast Extract	3 g

Dextrose	3 g

Bromocresol Purple	0.02 g

L-Lysine Hydrochloride	10 g

L-Tryptophan	0.5 g

Agar	3 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 6.7로 조정한 후 시험관에 분주하여 121℃에서 15분간 멸균하여 사용한다.

19) VP 반유동배지(Voges-Proskauer Broth)

Yeast Extract	1 g

Casein Peptone	7 g

Soy Peptone	5 g

Dextrose	10 g

Sodium Chloride	5 g

Agar	3 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹인 후 pH 7.0～7.2로 조정한 후 시험관에 분주하여 121℃에서 15분간 멸균한다.

20) Purple Broth Base

Proteose Peptone	10 g

Beef Extract	1 g

Sodium Chloride	5 g

Bromocresol Purple	0.015 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 6.8±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

21) Moeller Basal 배지(Moeller Basal Broth)

Peptone	5 g

Beef Extract	5 g

Dextrose	0.5 g

Bromocresol Purple	0.01 g

Cresol Red	0.005 g

Pyridoxal Hydrochloride	0.005 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 6.0으로 조정한 후 시험관에 분주하여 121℃ 에서 15분간 멸균한다. 균을 접종 후 멸균 유동파라핀을 중층한다.

22) ONPG 배지(O-nitrophenyl-β-D-galacto-pyranoside Broth)

Peptone	7.5 g

Sodium Chloride	3.75 g

ONPG	1.5 g

Disodium Phosphate	0.355 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 7.5으로 조정한 후 시험관에 2.5 mL 씩 분주하여 사용한다.

23) TSB 배지(Tryptic Soy Broth)

Tryptone	17 g

Soytone	3 g

Dextrose	2.5 g

Sodium Chloride	5 g

Dipotassium Phosphate	2.5 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 7.3±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

24) 3% Ogawa 배지

Monopotassium Phosphate	3.0 g

Sodium Glutamate	1.0 g

Glycerin	6.0 mL

2% Malachite Green	6.0 mL

위의 성분을 증류수 100 mL에 녹이고 121℃에서 15분간 멸균한다. 50℃로 냉각시킨 후 달걀액(Egg-Homogenate) 200 mL을 넣고 충분히 혼합하여 5 mL씩 멸균시험관에 분주한 다음 85～90℃에서 60분간 가열한다.

25) TOS-MUP 배지

Trypticase peptone	10 g

Yeast Extract	1 g

KH2PO4	3 g

K2HPO4	4.8 g

(NH4)2SO4	3 g

Magnesium Sulfate 7H2O	0.2 g

(R)-Cysteine-HCl·H2O	0.5 g

Sodium propionate	15 g

TOS(Galactooligosaccharide)	10 g

Agar	15 g

위의 성분을 증류수 950 mL에 녹이고 pH를 6.3±0.2로 조정한 후 115℃에서 15분간 멸균하여 50℃정도로 식힌 다음 MUP(mupirocin) supplement(1 mg/mL)를 주사필터(0.2 μm)한 후 50 mL를 위의 배지에 첨가한다.

26) Liver 한천배지(Liver agar)

Beef Liver Infusion	20 g

Proteose Peptone	10 g

Sodium Chloride	5 g

Agar	20 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹인 후 121℃에서 15분간 멸균한다. 일반세균의 증식을 억제하기 위하여 배지에 Bactracin(25 units/mL), Vancomycin(20 ㎍/mL), Polymyxin B(5 units/mL), Nalidixic acid (5 ㎍/mL)과 Cycloheximide(100 ㎍/mL)을 첨가한다.

27) 클로스트리디움 퍼프린젠스 한천배지(Clostridium Perfringens Agar)

Heart Infusion	5 g

Casein Peptone	10 g

Proteose Peptone	10 g

Sodium Chloride	5 g

Lactose	10 g

Phenol Red	0.05 g

Agar	20 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 7.5±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균 후 배지를 50℃정도로 식혀 카나마이신을 200 ㎍/mL 농도로, 난황액(시액 8)을 10%가 되도록 첨가한다.

28) Selenite F 배지(Selenite F Broth)

Polypeptone	5.0 g

Lactose	4.0 g

Disodium Phosphate	10.0 g

Sodium Selenite	4.0 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 7.0±0.2로 조정하고 가열 용해한다.

29) SS 한천배지(Salmonella Shigella Agar)

Beef Extract	5.0 g

Proteose Peptone	5.0 g

Lactose	10.0 g

Bile Salt No.3	8.5 g

Sodium Citrate	8.5 g

Sodium Thiosulfate	8.5 g

Ferric Citrate	1.0 g

Agar	13.5 g

Brilliant Green	0.0033 g

Neutral Red	0.025 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 7.0±0.2로 조정하고 가열 용해한다.

30) MacConkey 한천배지(MacConkey Agar)

Peptone	17.0 g

Polypeptone	3.0 g

Lactose	10.0 g

Bile Salts No.3	1.5 g

Sodium Chloride	5.0 g

Neutral Red	0.03 g

Crystal Violet	0.001 g

Agar	13.5 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 7.1±0.2로 조정하고 가열 용해한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

31) Desoxycholate Citrate 한천배지(Desoxycholate Citrate Agar)

Beef Extract	5.0 g

Peptone	5.0 g

Lactose	10.0 g

Sodium Citrate	8.5 g

Sodium Thiosulfate	5.4 g

Ferric Ammonium Citrate	1.0 g

Sodium Desoxycholate	5.0 g

Neutral Red	0.02 g

Agar	12.0 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 7.5±0.2로 조정하고 가열 용해한다.

32) TSI 사면배지(Triple Sugar Iron Agar)

Beef Extract	3.0 g

Yeast Extract	3.0 g

Peptone	20.0 g

Lactose	10.0 g

Sucrose	10.0 g

Dextrose	1.0 g

Ferrous Sulfate	0.2 g

Sodium Chloride	5.0 g

Sodium Thiosulfate	0.3 g

Phenol Red	0.24 g

Agar	13.0 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 7.4±0.2로 조정하고 가열용해 한 후 시험관에 분주하여 121℃에서 15분간 멸균한 후 사면으로 굳혀 사용한다.

33) Cooked Meat 배지(Cooked Meat Medium)

Beef Heart	454 g

Proteose Peptone	20 g

Dextrose	2 g

Sodium Chloride	5 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 7.2±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

34) GAM 배지(Gifu Anaerobic Medium)

Peptone	10 g

Soytone	3 g

Proteose Peptone	10 g

Bovine Serum Albumin	13.5 g

Yeast Extract	5 g

Beef Extract	2.2 g

Monopotassium Phosphate	2.5 g

Liver Extract	1.2 g

Sodium Chloride	3 g

L-Cystein	0.3 g

Sodium Thioglychollate	0.3 g

Agar	1.5 g

Sugar	10 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 가열용해한 후 시험관에 분주하여 115℃에서 15분간 멸균 후 급냉시켜 사용한다. 당 분해능 확인시험을 위해 Sugar는 시험항목에 해당하는 것을 선택하여 사용한다.

35) Listeria 증균배지(Listeria Enrichment Broth)

Tryptone	17 g

Soytone	3 g

Glucose	2.5 g

Sodium Chloride	5 g

Dipotassium Phosphate	2.5 g

Yeast Extract	6 g

Cycloheximide	0.05 g

Acriflavin HCl	0.015 g

Nalidixic Acid	0.04 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 7.3±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

36) UVM Modified Listeria 증균배지(UVM Modified Listeria Enrichment Broth)

Tryptose	10 g

Beef Extract	5 g

Yeast Extract	5 g

Sodium Chloride	20 g

Disodium Phosphate	9.6 g

Monopotassium Phosphate	1.35 g

Esculin	1 g

Nalidixic Acid	0.02 g

Acriflavin HCl	0.012 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 7.2±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

37) Fraser 배지(Fraser Broth)

Tryptose	10 g

Beef Extract	5 g

Yeast Extract	5 g

Sodium Chloride	20 g

Disodium Phosphate	12.0 g

Monopotassium Phosphate	1.35 g

Esculin	1 g

Ferric citrate                               0.5 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 121℃에서 15분간 멸균하여 50℃로 식힌 후 다음의 Supplement를 차례로 여과멸균하여 가한다.

Supplement ; Nalidixic Acid 0.02 g, Acriflavin HCl 0.025 g, Lithium Chloride 3 g

38) Oxford 한천배지(Oxford Agar)

Columbia blood agar base                         39 g

Esculin                                            1 g

Ferric ammonium citrate                          0.5 g

Lithium chloride                                  15 g

Agar                                              2 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 7.0±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균하고 50℃정도로 식힌 후 다음의 Supplement를 차례로 여과멸균하여 가한다.

Supplement ; Cycloheximide 0.4 g, Colistin Sulfate 0.02 g,  Acriflavin 0.005 g, Cefotetan 0.002 g, Fosfomycin 0.01 g

39) LPM 한천배지(Lithium Chloride Phenylethanol Moxalactam Agar)

Tryptose	10 g

Beef Extract	3 g

Sodium Chloride	5 g

Lithium Chloride	5 g

Glycine Anhydride	10 g

Phenylethanol	2.5 g

Agar	15 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 7.3±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균하고 이를 50℃정도로 식힌 후 Moxalactam 0.02 g을 여과멸균하여 가한다.

40) Tryptic Soy 한천배지(Tryptic Soy Agar)

Tryptose	17 g

Soytone	3 g

Glucose	2.5 g

Sodium Chloride	5 g

Dipotassium Phosphate	2.5 g

Agar	15 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 7.3±0.2로 조정 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

41) TSC 한천배지(Tryptose-Sulfite-Cycloserine Agar)

Tryptose	15 g

Yeast Extract	5 g

Soytone	5 g

Ferric Ammonium Citrate	1 g

Sodium Metabisulfite	1 g

Agar	20 g

위의 성분에 증류수  900 mL를 가하여 녹인 후 pH 7.6±0.2로 조정한다. 이를 500 mL Flask에 250 mL씩 분주한 후 121℃에서 15분간 멸균한다. 이를 50℃정도로 식힌 후 D-cycloserine solution 20 mL와 난황액(시액 8)을 10%가 되도록 첨가한다(다만, 클로스트리디움 퍼프린젠스 균수 측정 시(4.14.2), 난황액(시액 8)을 첨가하지 않고 사용할 수 있다).

D-cycloserine solution은 D-cycloserine 1 g을 200 mL의 증류수로 용해한 후 여과멸균하여 4℃로 보관하여 사용한다.

42) mEC 배지(mEC Broth)

Tryptone	20 g

Bile Salt No.3	1.5 g

Lactose	5.0 g

Dipotassium Phosphate	4.0 g

Monopotassium Phosphate	1.5 g

Sodium Chloride	5 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 6.9±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균하여 식히고, Novobiocin Sodium 0.02 g을 여과멸균하여 가한다.

43) MacConkey Sorbitol 한천배지(MacConkey Sorbitol Agar)

Peptone	15.5 g

Proteose Peptone	3 g

D-Sorbitol	10 g

Bile Salts	1.5 g

Sodium Chloride	5 g

Agar	15 g

Neutral Red	0.03 g

Crystal Violet	0.001 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹인 후 pH 7.1로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

44) PSBB 배지(Peptone Sorbitol Bile Broth)

Disodium Phosphate	8.23 g

Monosodium Phosphate	1.2 g

Bile Salts No.3	1.5 g

Sodium Chloride	5 g

D-Sorbitol	10 g

Peptone	5 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹인 후 pH 7.6으로 조정하고 121℃에서 15분간 멸균하여 사용한다.

45) CIN 한천배지(Cefsulodin Irgasan Novobiocin Agar)

Peptone	20 g

Yeast Extract	2 g

Mannitol	20 g

Sodium Pyruvate	2 g

Sodium Chloride	1 g

Magnesium Sulfate Heptahydrate	0.01 g

Agar	12 g

위의 성분을 750 mL의 증류수에 녹여 충분히 끓인 후 80℃로 식히고 95% 에탄올에 녹인 0.4% Irgasan 1mL 넣어 완전히 섞는다. 다음으로 200 mL의 desoxycholate 용액(증류수 200 mL에 sodium desoxycholate 0.5 g을 녹인 것)에 neutral red 10 mL(3 ㎎/mL), crystal violet 10 mL(0.1 ㎎/mL), cefsulodin 10mL(1.5 ㎎/mL), novobiocin 10 mL(0.25 ㎎/mL)를 가하여 준다. 천천히 흘리면서 10% strontium chloride 10mL를 넣는다. 1N NaOH로 pH 7.4로 조정한 후 분주하여 사용한다. 이 때 멸균 후 첨가하는 모든 시약은 멸균하여 사용한다.

46) MYP 한천배지(Mannitol Egg Yolk Polymyxin agar)

Beef Extract	1 g

Peptone	10 g

Mannitol	10 g

Sodium Chloride	10 g

Phenol Red	0.025 g

Agar	15 g

위의 성분을 증류수 900 mL에 녹이고 pH 7.2로 조정한 후 500 mL 플라스크에 225 mL씩 분주하고 121℃에서 15분간 멸균하여 50℃로 식힌 다음 Polymyxin B 용액(10,000 unit/mL) 2.5 mL와 난황액(시액 8) 12.5 mL를 각각 넣어 혼합한다.

47) HUNT(CEB) 배지(Hunt broth, Campylobacter Enrichment Broth)

Beef Extract	10 g

Peptone	10 g

Sodium Chloride	5 g

Yeast Extract	6 g

Ferrous Sulfate	0.25 g

Sodium Metabisulfite	0.25 g

Sodium Pyruvate	0.25 g

위의 성분을 증류수 950 mL에 녹인 후 pH 7.5로 조정하고 121℃에서 15분간 멸균하여 식힌 다음 용혈시킨 말 혈액(Lysed Horse Blood) 50 mL, Supplement A 또는 Supplement B를 여과 멸균하여 가한다.

Supplement A : Sodium Cefoperazone 0.032 g, Trimethoprim Lactate 0.015 g, Vancomycin 0.01 g, Amphotericin B 0.002 g

Supplement B : Sodium Cefoperazone 0.032 g, Trimethoprim Lactate 0.015 g, Vancomycin 0.01 g, Rifampicin 0.005 g

48) Modified Campy Blood Free 한천배지(Modified Campy Blood Free Agar)

Meat Extract	10.0 g

Yeast Extract	2.0 g

Peptone	10.0 g

Sodium Chloride	5.0 g

Bacteriological Charcoal	4.0 g

Casein Hydrolysate	3.0 g

Sodium Deoxycholate	1.0 g

Ferrous Sulphate	0.25 g

Sodium Pyruvate	0.25 g

Agar	12.0 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 7.4로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균하고 50℃정도로 식힌 후 다음의 Supplement를 차례로 여과 멸균하여 가한다.

Supplement : Sodium Cefoperazone 0.032 g, Rifampicin 0.005 g, Amphotericin B 0.002 g

49) Abeyta-Hunt Blood 한천배지(Abeyta-Hunt Blood Agar)

Heart infusion broth	25 g

Agar	15 g

Yeast Extract	2 g

위의 성분을 증류수 950 mL에 녹여 pH 7.4로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균하여 식힌 다음 용혈시킨 말 혈액(Lysed Horse Blood) 50 mL을 가하고 다음의 Supplement를 차례로 여과멸균하여 가한다.

Supplement : Sodium Cefoperazone 0.032 g, Rifampicin 0.005 g, Amphotericin B 0.002 g

50) TPGY 배지(Trypticase Peptone Glucose Yeast Extract Broth)

Trypticase	50 g

Peptone	5 g

Yeast Extract	20 g

Dextrose	4 g

Sodium Thioglycollate	1 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹인 후 pH 7.0으로 조정하고, 15 mL씩 시험관에 분주하여 121℃에서 10분간 멸균한다.

51) Liver-Veal 난황한천배지(Liver-Veal Egg Yolk Agar)

Liver Infusion	50.0 g

Veal Infusion	500.0 g

Proteose Peptone	20.0 g

Neopeptone	1.3 g

Tryptone	1.3 g

Dextrose	5 g

Soluble Starch	10 g

Isoelectric Casein	2 g

Sodium Chloride	5 g

Sodium Nitrate	2 g

Gelatin	20 g

Agar	15 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 121℃에서 15분간 멸균한 후, 50℃정도로 식혀 난황액(시액 8)을 10%가 되도록 무균적으로 가한다.

52) 혐기성 난황 한천배지(Anaerobic Egg Yolk Agar)

Yeast Extract	5 g

Tryptone	5 g

Proteose Peptone	20 g

Sodium Chloride	5 g

Agar	20 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 7.0으로 조정하고, 121℃에서 15분간 멸균한 후 50℃정도로 식혀 난황액(시액 8) 40 mL를 무균적으로 가한다.

53) 세균수 건조필름배지 Ⅰ

Pancreatic Digest of Casein	3.4 g

Yeast Extract	2.4 g

Sodium Pyruvate	6.8 g

Dextrose	0.6 g

Dipotassium Phosphate	1.3 g

Monopotassium Phosphate	0.4 g

Guar Gum	91.4 g

2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride	0.0205 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹인 후 121℃에서 15분간 멸균하여 건조필름을 제조한다.

54) 대장균군 건조필름배지 Ⅰ

Yeast Extract	9.6 g

Pancreatic Digest of Gelatin	20.9 g

Bile Salt No. 3	1.6 g

Peptic Digest of Animal Tissue	1.6 g

Lactose	21.4 g

Sodium Chloride	5.3 g

Crystal Violet	0.002 g

Neutral Red	0.1 g

Guar gum	65.7 g

2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride	0.11 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹인 후 121℃에서 15분간 멸균하여 건조필름을 제조한다.

55) 대장균 건조필름배지 Ⅰ

Yeast Extract	9.6 g

Pancreatic Digest of Gelatin	20.9 g

Bile Salt No. 3	1.6 g

Peptic Digest of Animal Tissue	1.6 g

Lactose	21.4 g

Sodium Chloride	5.3 g

Crystal Violet	0.002 g

Neutral Red	0.1 g

Guar gum	65.4 g

5-Bromo-4-Chloro-3-Indoxyl-beta-D-Glucuronic Acid,

Cyclohexyl Ammonium Salt	0.2 g

2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride	0.11 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹인 후 121℃에서 15분간 멸균하여 건조필름을 제조한다.

56) 펩톤수(Peptone water)

Peptone	10 g

Sodium Chlroride	5 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 7.2±0.2 되도록 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

57) RV 배지(Rappaport-Vassiliadis broth)

(1) Broth Base

Tryptone	5 g

NaCl	8 g

KH2PO4	1.6 g

Distilled water	1 L

(2) Magnesium chloride solution

MgCl2･6H2O	400 g

Distilled Water	1 L

(3) Malachite Green Oxalate Solution

Malachite Green Oxalate	0.4 g

Distilled Water	100 mL

완전한 배지를 준비하기 위해서 1,000 mL의 Broth base와 100 mL의 Magnesium chloride 용액과 10 mL의 Malachite green oxalate용액을 혼합한다(완전한 배지의 총량은 1110 mL이다). Broth base는 완전한 배지에 첨가되는 성분과 동일한 날에 준비하고 Magnesium Chloride 용액은 1년동안 실온에서 갈색병에 보관이 가능하다.

58) XLD 한천배지(Xylose Lysine Desoxycholate agar)

Yeast extract	3 g

L-Lysine	5 g

Xylose	3.75 g

Lactose	7.5 g

Sucrose	7.5 g

Sodium Desoxycholate	2.5 g

Ferric Ammonium Citrate	0.8 g

Sodium Thiosulfate	6.8 g

Sodium Chloride	5 g

Agar	15 g

Phenol Red	0.08 g

위의 성분에 증류수 1,000 mL를 가하여 가열용해한 후 사용한다. 단, 고압증기멸균해서는 안된다.

59) EE 배지(Enterobacteriaceae Enrichment broth)

Peptone	10.0 g

Glucose	5.0 g

Disodium Phosphate	8.0 g

Monopotassium Phosphate	2.0 g

Oxgall	20.0 g

Brilliant Green	0.015 g

위의 성분을 1,000 mL의 증류수에 가하여 100℃에서 30분간 가열용해 하여 사용한다.

60) CESA 한천배지(Chromogenic Enterobacter sakazakii Agar)

Tryptone	15.0 g

Soya Peptone	5.0 g

Sodium Chloride	5.0 g

Ferric Amonium Citrate	1.0 g

Sodium Desoxycholate	1.0 g

Sodium Thiosulphate	1.0 g

Chromogen	0.1 g

Agar	15.0 g

위의 성분을 1,000 mL의 증류수에 가열 용해한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

61) VRBG 한천배지(Violet Red Bile Gglucose Agar)

Yeast Extract	3.0 g

Peptone	7.0 g

Sodium Chloride	5.0 g

Bile Salts No. 3	1.5 g

Lactose	10.0 g

Neutral Red	0.03 g

Crystal Violet	0.002 g

Agar	15.0 g

Glucose	10.0 g

위의 성분을 1,000 mL의 증류수에 가열 용해하여 사용한다. 단 고압증기멸균을 해서는 안된다.

62) E. sakazakii 한천배지(E. sakazakii Agar)

Tryptone	20.0 g

Bile Salts No. 3	1.5 g

Sodium Thiosulphate	1.0 g

Ferric Ammonium Citrate	1.0 g

MUG α-D-glucopyranoside	0.05 g

Agar	15.0 g

위의 성분을 1,000 mL의 증류수에 가열 용해한 후, pH 7.0 ± 0.2 로 조정하고 121℃에서 15분간 멸균한다.

63) Baird-Parker 한천배지(Baird-Parker Agar)

Tryptone	10 g

Beef Extract	5 g

Yeast Extract	1 g

Sodium Pyruvate	10 g

Glycine	12 g

Lithium Chloride 6H2O	5 g

Agar	20 g

위의 성분을 증류수 950 mL에 녹이고 pH를 7.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다. 이를 50℃정도로 식힌 다음 0.1% Potassiun Tellurite가 첨가된 난황액(시액 8) 50 mL을 첨가한다.

64) Bismuth Sulfite 한천배지(Bismuth Sulfite Agar)

Peptone	10 g

Beef extract	5 g

Dextrose	5 g

Disodium Phosphate	4 g

Ferrous sulfate	12 g

Bismuth Sulfite Indicator	8 g

Brilliant Green	0.025 g

Agar	20 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹이고 pH 7.2로 조정한 후 가열하여 사용한다.

65) PALCAM 한천배지(Polymyxin Acriflavin LiCl Ceftazidime Esculin Mannitol Agar)

Peptone	23 g

Mannitol	10 g

Sodium Chloride	5 g

Starch	1 g

Ferric Aammouium Citrate	0.5 g

Esculin	0.8 g

Dextrose	0.5 g

Lithium Chloride	15.0 g

Phenol Red	0.08 g

Agar	13 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹이고 pH 7.2±0.2 로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다. 이를 50℃로 식히고 다음의 Supplement를 차례로 여과멸균하여 가한다.

Supplement : Polymyxin B sulfate 0.01 g, Acriflavin 0.005 g, Ceftazidime 0.02 g

66) TC-SMAC 한천배지(Tellurite Cefixime-Sorbitol MacConkey Agar)

Potassium tellurite	2.5 mg

(1% Potassium tellurite 용액 250 μL)

Cefixime	0.05 mg

(95% 에탄올 용액 1 L에 cefixime 50 mg을 녹인 용액 1 mL)

MacConkey Sorbitol 한천배지(배지 43) 1,000 mL을 121℃에서 15분간 멸균하고, 50℃정도로 식힌 다음 여과멸균한 위의 성분들을 차례로 가한다. 1% Potassium tellurite 용액은 4℃에서 1개월간, Cefixime 용액은 -20℃에서 1년간 보관이 가능하다.

67) Baird-Parker RPF한천배지(Baird-Parker RPF Agar)

Tryptone	1 g

Beef Extract	0.5 g

Yeast Extrac	0.1 g

Sodium Pyruvate	1 g

Glycine	1.2 g

Lithium Chloride 6H2O	0.5 g

Agar	2 g

위의 성분을 증류수 90 mL에 녹이고 pH를 7.2로 조정한 후 121℃ 15분간 멸균하여 50℃정도로 식힌 다음 RPF Supplement를 첨가한다.

Bovine Fibrinogen	0.375 g

Trypsin Inhibitor	2.5 mg

Rabbit Plasma	2.5 mL

Potassium Tellurite	2.5 mg

위의 성분을 멸균증류수 10 mL에 녹인다.

68) Bolton 배지(Bolton Broth)

Meat Pepton	10 g

Lactalbumin Hydrolysate	5 g

Yeast Extract	5 g

Sodium Chloride	5 g

Haemin	0.01 g

Sodium Pyruvate	0.5 g

α-Ketoglutaric acid	1 g

Sodium Metabisulphite	0.5 g

Sodium Carbonate	0.6 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹이고 pH를 7.4로 조정한 후 121℃ 15분간 멸균하여 50℃정도로 식힌 다음 용혈시킨 말 혈액(Lysed Horse Blood) 50ml을 무균적으로 첨가하고 다음의 Supplement를 물과 에탄올을 동량 섞은 용액 10ml에 녹인 후 여과멸균하여 가한다.

Supplement 조성 : Sodium Cefoperazone 20 mg, Trimethoprim 20 mg, Vancomycin 20 mg, Cyclohexamide 50 mg

69) 세균수 건조필름배지 Ⅱ

Peptone	5 g

Bonito meat extract(Erlich meat extract)	1 g

Yeast extract	2.5 g

Glucose	1 g

Potassium hydrogen phosphate	0.8 g

2,3,5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride	0.05 g

위의 성분을 1,000 mL에 녹인 후 121℃에서 15분간 멸균하여 건조필름을 제조한다.

70) 대장균군 건조필름배지 Ⅱ

Peptone	2 g

Bonito meat extract(Erlich meat extract)	8 g

Gall powder	1.5 g

Sodium deoxycholate	1 g

Sodium dodecyl sulfate	1 g

Potassium nitrate	1 g

Potassium hydrogen phosphate	1 g

Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside	0.03 g

5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-β-D-galactopyranoside	0.5 g

위의 성분을 1,000 mL에 녹인 후 121℃에서 15분간 멸균하여 건조필름을 제조한다.

71) 대장균 건조필름배지 Ⅱ

Peptone	2 g

Bonito meat extract(Erlich meat extract)	8 g

Gall powder	1.5 g

Sodium deoxycholate	1 g

Sodium dodecyl sulfate	1 g

Potassium nitrate	1 g

Potassium hydrogen phosphate	1 g

Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside	0.03 g

5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-β-D-galactopyranoside	0.5 g

6-chloro-3indoxyl-β-D-glucuronic acid	0.5 g

위의 성분을 1,000 mL에 녹인 후 121℃에서 15분간 멸균하여 건조필름을 제조한다.

72) MMGM(Minerals modified glutamate medium)

Lactose	10.0 g

L(+) Glutamic acid	6.35 g

L(+) Arginine monohydrochloride	0.02 g

L(-) Aspartic acid	0.024 g

L(-) Cystine	0.02 g

Sodium formate	0.25 g

Disodium potassium hydrogen phosphate	0.9 g

Ammonium chloride	2.5 g

Magnesium sulphate heptahydrate	0.1 g

Calcium chloride dihydrate	0.01 g

Ferric citrate scales	0.01 g

Nicotinic acid	0.001 g

Thiamine (Aneurinhydrochloride)	0.001 g

Pantothenic acid	0.001 g

Bromocresol purple	0.01 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 6.7 ± 0.1로 조정한 후 시험관에 10 mL 씩 분주하여 121℃에서 15분간 멸균한다.

73) BCIG 한천배지(5-bromo-4-chloro-3indolyl-β-D-glucuronide (BCIG) agar)

Tryptone	20.0 g

Bile salts No. 3	1.5 g

Agar	15.0 g

BCIG (as cyclohexylammonium salt)	0.075 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 7.2 ± 0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

74) mTSB 배지

Peptone from casein	17.0 g

Peptone from soymeal	3.0 g

Sodium chloride	1.5 g

Bile salts No. 3	2.5 g

D(+)glucose	2.5 g

Di-potassium hydrogen phosphate	4.0 g

위의 성분에 증류수를 가하여 1,000 mL로 만들고 끓여 녹인 후 121℃에서 15분간 멸균하고 pH 7.3으로 조정하여 사용한다. 단, O157 검사 시 또는 오염이 심한 검체의 경우, 위의 mTSB 배지(배지 74)를 50℃로 식힌 후, 8 mg/L농도의 여과멸균한 Novobiocin을 첨가하여 사용할 수 있다.

75) Preston 한천배지(Preston Agar)

Lab-Lemcopowder	10.0 g

Peptone	10.0 g

Sodium chloride	5.0 g

Agar	12.0 g

증류수 1,000 mL에 위의 성분 37.0 g을 녹이고 pH 7.5±0.2로 조정을 한 다음 121℃에서 15분간 고압증균 멸균한 후 50℃로 식힌다. Laked Horse Blood 52.6 mL과 지시대로 녹인 Supplement와 Campylobacter Growth Supplement를 첨가한다.

Supplement 조성

PolymyxinB	5,000 IU

Rifampicin	10 mg

Trimethoprim	10 mg

Cycloheximide	100 mg

76) Campy Cefex 한천배지(Campy Cefex Agar(CCA))

Brucella Agar(Difco 배지)	44.0 g

Ferrous sulfate	0.5 g

Sodium pyruvate	0.5 g

Sodium bisulfite	0.25 g

위의 성분을 증류수로 990 mL되게 용해하고 121℃에서 15분간 멸균하여 식히고 Cefoperazone 10 mL 및 Cycloheximide(200 mg/L)을 첨가한다.

77) Blaser's Campylobacter 한천배지(Blaser's Campylobacter Agar(BCA))

Yeast extract	5.0 g

Peptone	15.0 g

NaCl	5.0 g

Agar	12.0 g

Liver digest	2.5 g

위의 성분에 증류수를 가하여 950 mL되게 용해하여 pH 7.0로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균하여 식히고 용혈된 말혈구(horse blood cell) 50 mL과  Campylobacter Supplement (A) (유제품의 경우 사용가능)를 권장량이 되게 첨가한다.

78) Preston 배지(Preston broth)

Lab-Lemco powder	10.0 g

Peptone	10.0 g

Sodium chloride	5.0 g

증류수 1,000 mL에 위의 성분을 녹이고 pH 7.5±0.2로 조정을 한 다음 121℃에서 15분간 고압증균 멸균한 후 50℃로 식힌다. Laked Horse Blood 50 mL과 지시대로 녹인 Preston Supplement와 Campylobacter Growth Supplement를 첨가한다.

- Preston Supplement 조성

Polymyxin B                             5,000 IU

Rifampicin                                10.0 mg

Trimethoprim                             10.0 mg

Cycloheximide                           100.0 mg

- Campylobacter Growth Supplement 조성

Sodium pyruvate                          250 mg

Sodium metabisulphite                     250 mg

Ferrous sulphate(hydrated salt)            250 mg

79) 혈액한천배지(Blood Agar)

Tryptone	15.0 g

Agar	15.0 g

NaCl	5.0 g

Soytone	5 g

위의 성분에 증류수를 가하여 950 mL로 만들고 가열 용해한 후 pH 7.3이 되도록 맞춘 다음 121℃로 15분간 고압증기 멸균한다. 고압멸균 시킨 배지를 약 50℃로 냉각시킨 후 양의 탈 섬유소 혈액을 5%(50 mL)가 되도록 첨가한 다음 사용한다.

80) Lowenstein-Jensen 사면배지

Asparagine	3.6 g

Monopotassium Phosphate	2.4 g

Magnesium Sulfate	0.24 g

Magnesium Citrate	0.6 g

Potato Flour	30.0 g

Malachite Green	0.4 g

위의 성분을 glycerol 12 mL을 함유한 증류수 600 mL에 가하여 배지가 끓기 직전까지 열을 가하면서 완전히 녹인 후 121℃에서 15분간 멸균한 후 50℃정도가 되도록 식힌다. 이 때 1,000 mL의 오염되지 않은 전란(whole egg)을 준비하여 거품이 생기지 않도록 잘 섞은 후 위의 배지에 거품이 생기지 않도록 잘 섞어준다. 뚜껑이 있는 튜브(screw-capped tube)에 섞은 배지를 분주한 후 사면배지가 되도록 잘 고정시켜 응고시킨 후 85℃에서 45분간 농축시킨다.

81) Middlebrook 7H10 한천배지

Ammonium Sulfate	0.5 g

Monopotassium Phosphate	1.5 g

Disodium Phosphate	1.5 g

Sodium Citrate	0.4 g

Magnesium Sulfate	25.0 mg

Calcium Chloride	0.5 mg

Zinc Sulfate	1.0 mg

Copper Sulfate	1.0 mg

L-Glutamic Acid (sodium salt)	0.5 g

Ferric Ammonium Citrate	0.04 g

Pyridoxine Hydrochloride	1.0 mg

Biotin	0.5 mg

Malachite Green	250.0 μg

Agar	15.0 g

* BBL Middlebrook OADC Enrichment

Sodium Chloride	8.5 g

Dextrose	20.0 g

Bovine Albumin (Fraction V)	50.0 g

Catalase	0.03 g

Oleic Acid	0.6 mL

Middlebrook 7H10 powder 19 g에 증류수를 900 mL과 glycerol 5 mL을 가하고 잘 섞은 후 완전히 녹이기 위하여 1분간 끓인 다음 121℃에서 15분간 멸균한다. 50∼55℃까지 식힌 후 무균적으로 Middlebrook OADC Enrichment를 100 mL 섞는다.

82) Serum Dextrose 배지(Serum Dextrose broth)

Tryptose	10 g

Beef extract	3 g

NaCl	5 g

증류수 950 mL을 가하고 121℃에서 15분간 멸균한 후 56℃에서 30분간 불활성화(inactivation)한 horse serum 과 dextrose 50 g을 첨가한다.

83) Serum Dextrose 한천배지(Serum Dextrose Agar)

Peptone	10.0 g

Meat extract	5.0 g

Sodium chloride	5.0 g

Agar	20.0 g

위의 성분에 증류수를 가하여 950 mL로 만들고 pH 7.4가 되도록 조정한 다음 121℃로 15분간 고압증기 멸균한 후 약 50℃의 항온수조에 보관한다. Fetal bovine serum 100 mL내에 Dextrose 20 g을 녹이고 여과하여 제조한 것 50 mL을 배지에 첨가한다. 일반세균의 증식을 억제하기 위하여 배지에 Bacitracin(25 units/mL), Vancomycin (20 ㎍/mL), Polymyxin B(5 units/mL, Nalidixic acid(5 ㎍/mL)과 Cycloheximide(100 ㎍/mL)을 첨가한다.

84) Brucella 한천배지(Brucella Agar)

Pancreatic Digest of Casein	10.0 g

Peptic Digest of Animal Tissue	10.0 g

Dextrose	1.0 g

Yeast Extract	2.0 g

Sodium Chloride	5.0 g

Sodium Bisulfite	0.1 g

Agar	15.0 g

증류수를 1,000 mL 가하고, 완전히 녹이기 위해 1분간 가열한 뒤 121℃에서 15분간 멸균한 후 fibrin을 제거한 (비동화: 56℃, 30분 동안 가열) bovine serum을 5～10% 되도록 첨가한다.

85) Brucella 배지(Brucella broth)

Pancreatic Digest of Casein	10.0 g

Peptic Digest of Animal Tissue	10.0 g

Dextrose	1.0 g

Yeast Extract	2.0 g

Sodium Chloride	5.0 g

Sodium Bisulfite	0.1 g

증류수를 1,000 mL 가하고, 끓여서 녹인 뒤 121℃에서 15분간 멸균한 후 fibrin을 제거한 (비동화: 56℃, 30분동안 가열) bovine serum을 5～10% 되도록 첨가한다.

86) 피루베이트 고형배지(pyruvate-based solid medium)

Enzyme Digest of Casein	3.6 g

Monopotassium Phosphate	2.4 g

Magnesium Sulfate	0.24 g

Magnesium Citrate	0.6 g

Potato Flour	30.0 g

Malachite Green	0.4 g

위의 성분을 Sodium pyruvate 7.2 g을 함유한 증류수 600 mL에 가하여 배지가 끓기 직전까지 열을 가하면서 완전히 녹인 후 121℃에서 15분간 멸균한 후 50℃정도가 되도록 식힌다. 이 때 1,000 mL의 오염되지 않은 전란(whole egg)을 준비하여 거품이 생기지 않도록 잘 섞은 후 위의 배지에 거품이 생기지 않도록 잘 섞어준다. 뚜껑이 있는 튜브(screw-capped tube)에 섞은 배지를 분주한 후 사면배지가 되도록 잘 고정시켜 응고시킨 후 85℃에서 45분간 농축시킨다.

87) MRS 배지

Enzyme Digest of Casein	10 g

Meat Extract	10 g

Yeast Extract	4 g

Glucose	20 g

Tween 80	1.08 g

Triammonium Citrate	2 g

Sodium Acetate	5 g

Magnesium Sulfate 7H2O	0.2 g

Manganese Sulfate 4H2O	0.05 g

Dipotassium hydrogen Phosphate	2 g

Agar	15 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹이고 pH를 5.7±0.1로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

88) Tetrathionate 배지(Tetrathionate Broth)

(1) Tetrathionate broth base

Polypeptone	5 g

Bile salts	1 g

Calcium carbonate	10 g

Sodium thiosulfate･5H2O	30 g

Distilled water	1 L

1,000 mL 멸균증류수에 배지성분을 부유시켜서 섞은 후 끓인다(배지성분이 침전되어 있으면 녹지 않는다). 최종 pH가 8.4±0.2가 되도록 한 뒤 45℃이하로 식혀서 5～8℃에 보관한다.

(2) Iodine-potassium iodide (I-KI) solution

Potassium iodide	5 g

Iodine, resublimed	6 g

Distilled water, sterile	20 mL

5 mL의 멸균증류수에 Potassium iodide를 용해시킨 뒤 iodine을 첨가하고 완전히 녹인 후 증류수를 가하여 20 mL로 한다.

(3) Brilliant green solution

Brilliant green dye, sterile	0.1 g

Distilled water, sterile	100 mL

사용하려고 하는날, 20 mL의 I-KI 용액과 10 mL의 Brilliant green 용액을 Tetrathionate broth base에 첨가하고 서서히 교반하면서 배지침전물들을 재부유시킨 뒤 20×150 ㎜ 또는 16×150 ㎜의 멸균된 시험관에 무균적으로 10 mL씩 분주한다. 배지에 I-KI와 dye 용액을 첨가한 뒤에는 가열해서는 아니 된다.

89) RVS 배지(Rappaport-Vassiliadis soya peptone Broth)

Soya peptone	4.5 g

Sodium Chloride	7.2 g

Potassium Dihydrogen Phosphate	1.26 g

Di-Potassium Dihydrogen Phosphate	0.18 g

Magnesium Chloride, Anhydrous	13.58 g

Malachite Green Oxalate	0.036 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 5.6±0.2로 조정하고 잘 섞어 배지가 녹을 때까지 끓인 후 10 mL씩 분주하여 115℃에서 15분간 멸균한다.

90) BG Sulfa 한천배지(Brilliant Green Sulfa Agar)

Yeast extract	3 g

Protease Peptone No.3	10 g

Lactose	10 g

Saccharose	10 g

Sodium Sulfapyridine	1.0 g

Sodium chloride	5.0 g

Agar	20 g

Brilliant Green	0.0125 g

Phenol Red	0.08 g

위의 성분 59 g을 증류수 1,000 mL에 넣고 pH 6.9로 조정하고 분말이 완전히 용해 되도록 1분간 끓인다. 이 때 과도하게 가열하면 선택성이 떨어지므로 주의한다. 고압증기 멸균하여 사용한다.

91) HE 한천배지(Hektoen Enteric Agar)

Peptone	12 g

Yeast extract	3 g

Bile salts No. 3	9 g

Lactose	12 g

Sucrose	12 g

Salicin	2 g

NaCl	5 g

Sodium thiosulfate	5 g

Ferric ammonium citrate	1.5 g

Bromthymol blue	0.065 g

Acid fuchsin	0.1 g

Agar	14.0 g

Distilled water	1 L

가끔 교반시키면서 약 1분 동안 가열한 뒤 항온수조에서 냉각시킨다. 페트리접시(Petridish)에 20 mL씩 분주하고 뚜껑을 열고 2시간가량 굳힌다. 최종 pH는 7.6±0.2로 하고, 1일 이상 보관해서는 아니 된다.

92) XLT4 한천배지(XLT4 Agar)

Proteose Peptone No.3	1.6 g

Yeast Extract	3.0 g

L-Lysine	5.0 g

Xylose	3.75 g

Lactose	7.5 g

Saccharose	7.5 g

Ferric Ammonium Citrate	0.8 g

Sodium Thiosulfate	6.8 g

Sodium Chloride	5.0 g

Agar	18.0 g

Phenol Red	0.08 g

위의 성분 59 g을 증류수 1,000 mL에 넣고 여기에 4.6 mL XLT Agar supplement를 넣고 분말이 완전히 용해되도록 1분간 끓인다. 마지막 pH는 7.4±0.2로 맞추고 고압증기멸균은 하지 않는다.

93) LIA 사면배지(Lysine Iron Agar)

Peptone	5.0 g

Yeast Extract	3.0 g

Dextrose	1.0 g

L-Lysine HCl	10.0 g

Ferric Ammonium Citrate	0.5 g

Sodium Thiosulfate	0.04 g

Bromcresol Purple	0.02 g

Agar	15.0 g

위 성분을 증류수 1,000 mL에 녹인 후 pH 6.7±0.2로 조정하고 121℃, 12분간 멸균한다.

94) EC-MUG 배지

EC 배지 l,000 mL에 MUG(4-methylumbelliferyl-β-d-glucuronide) 50 ㎎을 첨가하여 시험관에 분주하여 121℃에서  15분간 멸균한다.

95) Lauryl Sulfate Tryptose (LST) Broth

Tryptose or trypticase	20 g

Lactose	5 g

K2HPO4	2.75 g

NaCl	5 g

Sodium lauryl sulfate	0.1 g

위의 성분을 증류수로 1,000 mL 되게 제조하여 pH 6.8로 조정한 다음 발효관(Duram tube)을 넣은 시험관에 10 mL씩 분주하고, 고압증기멸균한다. 필요에 따라 MUG 50 ㎎을 첨가하여 사용한다.(LST-MUG)

96) Violet Red Bile Agar(VRBA)

Yeast extract	3.0 g

Peptone	7.0 g

Lactose	10.0 g

Bile salts No.3	1.5 g

Sodium chloride	5.0 g

Neutral red	0.03 g

Crystal violet	0.002 g

Agar	15.0 g

위의 성분에 증류수를 가하여 1,000mL로 만들고 pH 7.3～7.5가 되도록 맞춘 다음 2분간 끓여서 용해시켜 사용한다. 멸균은 하지 않는다.

97) ITC 배지(Irgasan, Ticarcillin and potassium chlorate broth)

Enzymatic digest of casein	10.0 g

Yeast extract	1.0 g

Magnesium chloride hexahydrate(MgCl2.6H2O)	60.0 g

Sodium Chloride	5.0 g

Malachite green, 0.2% aqueous solution	5.0 mL

위의 성분을 증류수 1000 mL에 녹여 pH 6.9±0.2로 조정하고, 988 mL를 취하여 121℃에서 15분간 멸균하여 식힌 후, 다음의 Supplement들을 가한다.

Supplement: Ticarcillin solution 1 mL(Ticarcillin 10 mg을 증류수 10 mL에  녹여 여과멸균한 것),  Irgasan solution 1 mL(Triclosan 10 mg을 95% Ethanol 10 mL에 녹인 것), Potassium chlorate solution 10 mL(Potassium chlorate 10 g을 증류수 100 mL에 녹여 여과 멸균한 것)

98) PEMBA한천배지(Polymyxin pyruvate egg yolk mannitol bromothymol blue Agar)

Enzymatic digest of casein	1.0 g

Mannitol	10.0 g

Sodium Chloride	2.0 g

Magnesium Sulfate	0.1 g

Disodium hydrogen phosphate	2.5 g

Potassium dihydrogen phosphate	0.25 g

Sodium Pyruvate	10.0 g

Bromothymol Blue	0.12 g

Agar	9∼18 g

위의 성분을 증류수 950 mL에 녹이고 pH 7.2 ± 0.2로 조정한 후 121°C에서 15분간 멸균한다. 50°C로 식힌 다음 Polymyxin B 용액 100,000 IU와  난황액(시액 8) 50 mL를 각각 넣어 혼합한다.

99) CCI 한천배지(Chromogenic Cronobacter Isolation agar)

Tryptic digest of casein	7.0 g

Yeast extract	3.0 g

Sodium chloride	5.0 g

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-α-D-glucopyranoside	0.15 g

Sodium desoxycholate	0.25 g

Ammonium iron(Ⅲ) citrate	1 g

Sodium thiosulfate	1 g

Agar	9∼18.0 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹이고 pH 7.3 ± 0.2로 조정한 후 121°C에서 15분간 멸균한다.

100) ALOA 한천배지(Agar Listeria according to Ottaviani and Agosti)

Enzymatic Digest of Animal Tissues	18.0 g

Enzymatic Digest of Casein	6.0 g

Yeast Extract	10.0 g

Sodium Pyruvate	2.0 g

Glucose	2.0 g

Magnesium Glycerophosphate	1.0 g

Magnesium Sulfate(anhydrous)	0.5 g

Sodium Chloride	5.0 g

Lithium Chloride	10.0 g

Disodium Hydrogen Phophate(anhydrous)	2.5 g

5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucopyranoside	0.05 g

Agar	12.0-18.0 g

위 성분을 증류수 930 mL에 녹이고 pH 7.2±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다. 50℃정도로 식히고 다음의 추가성분을 가한다. Supplement ①∼④는 여과 멸균하여  각 5 mL씩 가하고, Supplement ⑤는 121℃에서 15분간 멸균하여 50mL을 가한다.

ALOA agar Supplement: ① Nalidixic acid solution(0.02 g/5 mL), ② Ceftazidime solution(0.02 g/5 mL), ③ Polymyxin B solution(76700 IU/5 mL), ④ Cycloheximide solution(0.05 g/50% Ethanol 5 mL) ⑤ L-α-phosphatidylinositol solution(2 g/50 mL)

※ ④ Cycloheximide solution 대신 Amphotericin B solution(0.01 g/1M HCl 2.5 mL과 Dimethylformamide 7.5 mL 혼합용액)을 사용할 수 있다. 단, Amphotericin B solution을 사용할 경우 위의 배지 성분을 증류수 925 mL에 녹인다.

101) mCPC 한천배지(Modified Cellobiose- Polymyxin B-Colistin agar)

Peptone	10.0 g

Beef extract	5.0 g

Sodium chloride	20.0 g

1000× Dye stock solution*	1.0 mL

Agar	15.0 g

위 성분을 증류수 900 mL에 녹이고 pH 7.6으로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.  50℃ 정도로 식히고 supplement 용액을 첨가한다.

※ mCPC agar supplement 용액: Cellobiose 10.0g을 증류수 100 mL에 천천히 가열하여 녹인후 식힌다. Polymyxin B 100,000 units과 Colistin 400,000 units을 가한다.

* 1000× Dye stock solution: Bromothymol blue 4.0 g과 Cresol red 4.0 g을 95% ethanol 100 mL에 녹여서 제조

102) DRBC 한천배지

Enzymatic digest of animal and plant tissues      5 g

D-Glucose                                      10 g

Potassium dihydrogen phosphate                  1 g

Magnesium sulfate                              0.5 g

Dichloran                                     0.002 g

Rose bengal                                  0.025 g

Chloramphenicol                                0.1 g

Agar                                       12～15 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 121℃에서 15분간 멸균한다.

103) DG18 한천배지

Casein enzymatic digest                         5 g

D-Glucose                                     10 g

Potassium dihydrogen phosphate                 1 g

Magnesium sulfate                            0.5 g

Dichloran                                   0.002 g

Glycerol anhydrous                           220 g

Chloramphenicol                               0.1 g

Agar                                      12～15 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 121℃에서 15분간 멸균한다.

104) Half Fraser 배지(Half Fraser Broth)

Tryptose                                     10 g

Beef Extract                                  5 g

Yeast Extract                                 5 g

Sodium Chloride                              20 g

Disodium Phosphate                         12.0 g

Monopotassium Phosphate                   1.35 g

Esculin                                       1 g

Ferric citrate                                0.5 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 121℃에서 15분간 멸균하여 50℃로 식힌 후 다음의 Supplement를 차례로 여과멸균하여 가한다.

Supplement ; Nalidixic Acid 0.01 g, Acriflavin HCl 0.0125 g, Lithium Chloride 3 g

105) PALCAM 배지(PALCAM Broth)

Peptone                                      23 g

Mannitol                                     10 g

Sodium Chloride                               5 g

Starch                                        1 g

Ferric Aammouium Citrate                   0.5 g

Esculin                                      0.8 g

Dextrose                                    0.5 g

Lithium Chloride                             15 g

Phenol Red                                 0.08 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹이고 pH 7.2±0.2 로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다. 이를 50℃로 식히고 다음의 Supplement를 차례로 여과멸균하여 가한다.

Supplement : Polymyxin B sulfate 0.01 g, Acriflavin 0.005 g, Ceftazidime 0.02 g

4.4.2 시액

1) 멸균인산완충희석액(Butterfield's Phosphate Buffered Dilution Water)

인산이수소칼륨(KH2PO4) 34 g을 증류수 500 mL에 용해하고 1N 수산화나트륨 175 mL를 가해 pH를 7.2로 조정하고 여기에 증류수를 가하여 1,000 mL로 하여 인산완충용액으로 한다. 이것을 121℃에서 15분간 멸균한 다음 냉장고에 보존한다. 사용시에는 이 원액 1 mL를 취하여 멸균증류수 800 mL에 가하여 희석하고 이것을 멸균인산완충희석액으로 한다.

2) 멸균생리식염수(Saline)

Sodium Chloride 8.5 g에 증류수를 가하여 1,000 mL로 하고 121℃로 15분간 멸균한다.

3) 뉴-만 염색액

테트라클로로에탄(Tetrachloroethane) 40 mL와 에탄올(Ethanol)을 삼각플라스크에 취하고 70℃까지 가온한 후 여기에 메틸렌블루(Methylene blue) 1.0～2.0 g을 가하여 진탕 혼합하여 색소를 용해시킨 다음 냉각시킨다. 여기에 빙초산(glacial acetic acid) 6 mL를 천천히 가한 후 여과시켜 냉암소에 밀봉 저장한다. 염색액을 조제하여 시일이 경과한 것이나 또는 침전물이 생성된 것은 사용해서는 안 된다.

4) BTB-MR 지시약

Bromthymol Blue	0.2 g

Methyl Red	0.1 g

위의 성분을 95% 에탄올 300 mL에 용해한 후 정제수 200 mL을 혼합한다.

5) 젤라틴 인산완충용액

Gelatin	2 g

Disodium Phosphate	4 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹이고 pH를 6.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

6) Nitrite 지시약

가) A시약：Sulfanilic acid 1 g에 5N acetic acid 125 mL를 가하여 제조한다.

나) B시약：N-(1-naphthyl)ethylene dihydrochloride 0.25 g에 5N acetic acid 200 mL를 가하여 제조한다.

다) 5N acetic acid ; 빙초산(glacial acetic acid) 28.75 mL에 증류수 71.25 mL를 가하여 제조한다.

A시약 0.5 mL와 B시약 0.2 mL를 각각 반응액에 첨가한 후 관찰결과 적색-보라색을 띄면 양성으로 판정하며, 만일 반응이 없으면 Zn을 소량 첨가하여 색의 변화가 없으면 이를 양성으로 판정한다.

7) 펩톤식염완충액(Buffered Peptone Water)

Peptone	10 g

Sodium Chloride	5 g

Disodium Phosphate	3.5 g

Monopotassium Phosphate	1.5 g

위의 성분을 증류수 1000 mL에 가하여 pH를 7.2±0.2로 조정한 후 121℃에서 15분간 고압 멸균한다.

8) 난황액

달걀을 1시간 가량 0.1% Mercury Chloride(HgCl2)에 담근 후 꺼내 70% ethanol에 30분 가량 담궈 놓는다. 달걀을 꺼내 노른자만 취한 후 동량의 멸균생리식염수를 가하여 사용한다.

9) 0.1% Peptone solution

Peptone	1.0 g

위의 성분을 증류수 1,000 mL에 녹여 pH 7.0 ± 0.2 로 조정한 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

10) Ninhydrin 용액

Ninhydrin 3.5 g을 acetone과 butanol을 1:1로 혼합한 용액 100 mL로 용해하여 사용하며, 냉장보관한다.

11) Ziehl-Neelsen 염색액

(1) Saturated Alcoholic Basic Fuchsin(Stock Solution)

95% Ethyl alcohol                                   100 mL

Basic fuchsin                                           3 g

(2) Basic Fuchsin(Working Solution)

Saturated Alcoholic Basic Fuchsin                     10 mL

5% Phenol                                           90 mL

(3) Acid Alcohol

Hydrochloric acid                                    3.2 mL

95% Ethyl alcohol                                    97 mL

(4) Brilliant Green Counter stain

Brilliant green                                          1 g

0.01% NaOH                                       100 mL

12) 루골솔루션((iodine/potassium iodide solution)

100 g의 potassium iodide을 200∼300 mL의 물에 섞은 후, 50 g의 iodine을 넣고 녹을 때까지 가열해 주어 제조한 후 1 L의 멸균증류수에 넣어 빛이 차단된 용기에 보관한다.

4.5 세균수

세균수 측정법은 일반세균수를 측정하는 표준평판법, 건조필름법 또는 자동화된 최확수법(Automated MPN)을 사용할 수 있다.

4.5.1 일반세균수

가. 표준평판법

표준한천배지에 검체를 혼합 응고시켜 배양 후 발생한 세균 집락수를 계수하여 검체 중의 생균수를 산출하는 방법이다.

1) 시험조작

4.3 제조법에 따른 시험용액 1 mL와 10배 단계 희석액 1 mL씩을 멸균 페트리접시 2매 이상씩에 무균적으로 취하여 약 43～45℃로 유지한 표준한천배지(배지 1) 약 15 mL를 무균적으로 분주하고 페트리접시 뚜껑에 부착하지 않도록 주의하면서 조용히 회전하여 좌우로 기울이면서 검체와 배지를 잘 혼합하여 응고시킨다.

확산집락의 발생을 억제하기 위하여 다시 표준한천배지 3～5 mL를 가하여 중첩시킨다. 이 경우 검체를 취하여 배지를 가할 때까지의 시간은 20분 이상 경과하여서는 아니 된다. 응고시킨 페트리접시는 뒤집어 35±1℃에서 48±2시간(시료에 따라서 30±1℃ 또는 35±1℃에서 72±3시간) 배양한다(단 규정된 배양시간 전 일지라도 규격을 초과하는 집락이 계수되어 부적합 판정이 예상되는 경우 배양시간을 단축하여 판정할 수 있다). 집락수의 계산은 확산집락이 없고 1개의 평판당 15∼300개의 집락을 생성한 평판을 택하여 집락수를 계산하는 것을 원칙으로 한다. 시험용액을 가하지 아니한 동일 희석액 1 mL를 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다.

2) 집락수 산정

배양 후 생성된 집락수를 신속히 계산한다. 부득이할 경우에는 5℃에 보존시켜 24시간 이내에 산정한다. 집락수의 계산은 확산집락이 없고(전면의 1/2이하 일 때에는 지장이 없음) 1개의 평판당 15∼300개의 집락을 생성한 평판을 택하여 집락수를 계산하는 것을 원칙으로 한다. 전 평판에 300개 초과 집락이 발생한 경우 300에 가까운 평판에 대하여 밀집평판 측정법에 따라 계산한다. 전 평판에 15개 미만의 집락만을 얻었을 경우에는 가장 희석배수가 낮은 것을 측정한다.

3) 세균수의 기재보고

표준평판법에 있어서 검체 1 mL 중의 세균수를 기재 또는 보고할 경우에 그것이 어떤 제한된 것에서 발육한 집락을 측정한 수치인 것을 명확히 하기 위하여 1평판에 있어서의 집락수는 상당 희석배수로 곱하고 그 수치가 표준평판법에 있어서 1 mL 중(1 g 중)의 세균수 몇 개라고 기재보고하며 동시에 배양온도를 기록한다. 숫자는 높은 단위로부터 3단계에서 반올림하여 유효숫자를 2단계로 끊어 이하를 0으로 한다.

① 15 - 300CFU/ plate인 경우

N =	∑C
	{(1×n1)+(0.1×n2)}×(d)

N= 식육 g 또는 mL 당 세균 집락수

∑C = 모든 평판에 계산된 집락수의 합

n1 = 첫 번째 희석배수에서 계산된 평판수

n2 = 두 번째 희석배수에서 계산된 평판수

d = 첫 번째 희석배수에서 계산된 평판의 희석배수

구 분	희 석 배 수		CFU/g(mL)
	1:100	1:1,000
집 락 수	232 244	33 28	24,000

N =	(232+244+33+28)
	{(1×2) + (0.1×2)} × 10-2

= 537/0.022  = 24,409 = 24,000

② 15 CFU / plate 미만인 경우

구 분	희 석 배 수		CFU/g(mL)
	1:10	1:100
집 락 수	14 10	2 1	120

N =	(14+10)
	(1×2) × 10-1

= 24/0.2  = 120

4) 식육의 세균수 산출 방법

소 및 돼지 도체의 경우 균수는 도체 표면적당 집락수(CFU/㎝2)로서 환산되어야 한다. 희석배수 × 10(배지 접종량이 0.1 mL일 경우) × 집락수 × 40(재료 채취 용량)/10 ㎝ × 10 ㎝(1개부위 채취인 경우, 단 3개 부위를 채취할 경우는 300 ㎝2로 나누어 준다)로 산출한다. 닭의 경우는 mL당으로 집락수를 환산한다. 기타 시료는 집락수 × 희석배수로 mL당 또는 g당 세균수를 산출한다.

나. 건조필름법

1) 시험조작

4.3 제조법에 따른 시험용액 1 mL와 각 10배 단계 희석액 1 mL를 세균수 건조필름배지(배지 53 또는 69)에 각 2매 이상씩 접종한 후 잘 흡수시키고 35±1℃에서 48±2시간 배양한다. 집락수 계산은 생성된 붉은 집락수를 계산하고 그 평균 집락수에 희석배수를 곱하여 일반세균수로 하거나, 4.5.1 일반세균수에 따라 한다(검체에 따라 결과에 의심이 있을 경우에는 표준평판법에 따라 실시한다). 시험용액을 가하지 아니한 동일 희석액 1 mL를 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다.

다. 자동화된 최확수법(Automated MPN)

우유류, 유당분해우유, 가공유(무지유고형분 5.5% 미만인 제품 제외), 조제유류, 분유류, 소 도체, 돼지 도체, 닭 도체, 오리 도체에 한한다.

4.5.2 총균수

주로 원유 중 오염된 세균을 측정하기 위하여 일정량의 원유를 슬라이드그라스위에 일정면적으로 도말하고 건조시켜 염색한 후 현미경으로 검경하고 염색된 세균수를 측정한다. 측정된 세균수를 현미경 시야 면적과의 관계에 따라 검체 중에 존재하는 세균수를 측정하는 방법(직접현미경법: Breed method)이다.

가. 시험방법

채취된 시료를 약 30 ㎝ 진폭으로 7초에 25회 이상 흔들어 멸균 마이크로피펫으로 적량(100 μL)을 흡입하고 깨끗한 가아제로 피펫의 외벽에 부착된 시료를 잘 제거한 다음 슬라이드글라스 위에 적하한다. 도말침을 사용하여 1 ㎠ 면적에 고르게 도말하고 약 5분간 가온하여 건조시킨 다음, NewMan 염색액(시액 3)중에 순간적으로 적셔서 염색하고 남은 액을 즉시 흔들어 떨어뜨린 다음 건조시킨 후 물로 수세하여 다시 건조시킨다.

시료의 도말면적과 현미경의 시야면적과의 비, 즉 현미경 계수를 구한다. 유침렌즈를 사용하여 대물측미계로써 시야의 반경을 구하고 이 반경에 의하여 현미경시야의 면적을 구한다. 따라서 현미경 계수는 아래의 식에 의하여 구할 수 있다.

현미경계수 =	10,000(㎜2)
	r2 × 3.1416

r : 시야의 반경(㎜)

이 현미경 계수에 100을 곱하면 시료 1 mL에 대한 실 현미경 계수가 된다. 이러한 현미경계수하에서 16개 이상의 대표적인 시야를 검경하고 이 평균치에 실 현미경계수를 곱하면 시료 1 mL 중의 총균수가 된다.

4.6 세균발육시험

장기보존식품 중 통‧병조림식품, 레토르트식품에서 세균의 발육유무를 확인하기 위한 것이다.

가. 가온보존시험

시료 5개를 개봉하지 않은 용기·포장 그대로 배양기에서 35～37℃에서 10일간 보존한 후, 상온에서 1일간 추가로 방치한 후 관찰하여 용기․포장이 팽창 또는 새는 것은 세균발육 양성으로 하고 가온보존시험에서 음성인 것은 다음의 세균시험을 한다.

나. 세균시험

세균시험은 가온보존시험한 검체 5관에 대해 각각 시험한다.

1) 시험용액의 조제

검체 5관(또는 병)의 개봉부의 표면을 70% 알코올탈지면으로 잘 닦고 개봉하여 검체 25 g을 희석액 225 mL에 가하여 균질화 시킨다. 이 액의 1 mL를 멸균시험관에 채취하고 희석액 9 mL에 가하여 잘 혼합한 것을 시험용액으로 한다.

2) 시험법

시험용액을 1 mL씩 5개의 티오글리콜린산염 배지(배지 13)에 접종하여 35∼37℃에서 48±3시간 배양한 후, 5관 중 어느 하나라도 세균증식이 확인되면 세균발육 양성으로 한다. 시험용액을 가하지 아니한 동일 희석액 1 mL를 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다.

4.7 대장균군

대장균군은 Gram음성, 무아포성 간균으로서 유당을 분해하여 가스를 발생하는 모든 호기성 또는 통성 혐기성세균을 말한다. 대장균군 시험에는 대장균군의 유무를 검사하는 정성시험과 대장균군의 수를 산출하는 정량시험이 있다.

4.7.1 정성시험

가. 유당배지법

유당배지를 이용한 대장균군의 정성시험은 추정시험, 확정시험, 완전시험의 3단계로 나눈다. 4.3 제조법에 따른 시험용액 10 mL를 2배 농도의 유당배지(배지 2)에, 시험용액 1 mL 및 0.1 mL를 유당배지(배지 2)에 각각 3개 이상씩 가한다. 시험용액을 가하지 아니한 동일 희석액 1 mL을 각각 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다.

1) 추정시험

시험용액을 접종한 유당배지(배지 2)를 35～37℃에서 24±2시간 배양한 후 발효관내에 가스가 발생하면 추정시험 양성이다. 24±2시간 내에 가스가 발생하지 아니하였을 때에 배양을 계속하여 48±3시간까지 관찰한다. 이 때까지 가스가 발생하지 않았을 때에는 추정시험 음성이고 가스발생이 있을 때에는 추정시험 양성이며 다음의 확정시험을 실시한다.

2) 확정시험

추정시험에서 가스 발생한 유당배지발효관으로부터 BGLB 배지(배지 3)에 접종하여 35～37℃에서 24±2시간 동안 배양한 후 가스발생 여부를 확인하고 가스가 발생하지 아니하였을 때에는 배양을 계속하여 48±3시간까지 관찰한다. 가스발생을 보인 BGLB 배지(배지 3)로부터 Endo 한천배지(배지 5) 또는 EMB 한천배지(배지 6)에 분리 배양한다. 35～37℃에서 24±2시간 배양 후 전형적인 집락이 발생되면 확정시험 양성으로 한다. BGLB배지에서 35～37℃로 48±3시간 동안 배양하였을 때 배지의 색이 갈색으로 되었을 때에는 가스생성여부와 관계없이 반드시 완전시험을 실시한다.

3) 완전시험

확정시험의 Endo 한천배지(배지 5)나 EMB한천배지(배지 6)에서 전형적인 집락 1개 또는 비전형적인 집락 2개 이상을 보통한천배지(배지 8) 또는 Tryptic Soy 한천배지(배지 40)에 접종하여 35∼37℃에서 24±2시간 동안 배양한다. 보통한천배지 또는 Tryptic Soy 한천배지의 집락에 대하여 그람음성, 무아포성 간균이 증명되면 완전시험은 양성이며 대장균군 양성으로 판정한다.

나. BGLB 배지법

4.3 제조법에 따른 시험용액 1 mL와 0.1 mL를 2개씩 BGLB 배지(배지 3)에 가한다. 시험용액을 가하지 아니한 동일 희석액 1 mL을 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다. 대량의 시험용액을 가할 필요가 있을 때에는 대량의 배지를 넣은 발효관을 사용한다.

시험용액을 넣은 BGLB 배지(배지 3)을 35∼37℃에서 48±3시간 배양한 후 가스 발생을 인정하였을 때에는(배지를 흔들 때 거품 모양의 가스의 존재를 인정하였을 때에도) Endo 한천배지(배지 5) 또는 EMB 한천배지(배지 6)에 분리 배양한다. 이하의 조작은 가. 유당배지법의 확정시험 또는 완전시험 때와 같이 행하여 대장균군의 유무를 확인한다.

다. 데스옥시콜레이트 유당한천 배지법

4.3 제조법에 따른 시험용액 1 mL와 10배 단계 희석액 1 mL씩을 멸균 페트리접시 2매 이상씩에 무균적으로 취하고 약 43～45℃로 유지한 데스옥시콜레이트 유당한천배지(배지 9) 또는 VRBA 평판배지(배지 96) 약 15 mL를 무균적으로 분주하고 페트리접시 뚜껑에 부착하지 않도록 주의하면서 회전하여 검체와 배지를 잘 혼합한 후 응고 시킨다. 그리고 그 표면에 동일한 배지 또는 보통한천배지를 3～5 mL를 가하여 중첩시킨다. 시험용액을 가하지 아니한 동일 희석액 1 mL를 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다. 이것을 35～37℃에서 24±2 시간 배양 한 후 전형적인 암적색의 집락을 인정하였을 때에는 1개 이상의 집락을, 의심스러운 집락일 경우에는 2개 이상을 Endo 한천배지(배지 5) 또는 EMB 한천배지(배지 6) 또는 MacConkey 배지(배지 30)에서 분리 배양한다. 이하의 조작은 가. 유당배지법의 확정시험 또는 완전시험 때와 같이 행하고 대장균군의 유무를 시험한다.

4.7.2 정량시험

가. 최확수법

최확수란 이론상 가장 가능한 수치를 말하여 동일 희석배수의 시험용액을 배지에 접종하여 대장균군의 존재 여부를 시험하고 그 결과로부터 확률론적인 대장균군의 수치를 산출하여 이것을 최확수(MPN)로 표시하는 방법이다. 최확수는 연속한 3단계 이상의 희석시료(10, 1, 0.1 또는 1, 0.1, 0.01 또는 0.1, 0.01, 0.001)를 각각 5개씩(별표 1) 또는 3개씩(별표 2) 발효관에 가하여 배양 후 얻은 결과에 의하여 검체 1 mL중 또는 1 g중에 존재하는 대장균군수를 표시하는 것이다.

예로 검체 또는 희석검체의 각각의 발효관을 5개씩 사용하여 다음과 같은 결과를 얻었다면 최확수표에 의하여 시험검체 1 mL중의 MPN은 70으로 된다. 이 때 접종량이 1, 0.1, 0.01 mL일 때에는 70/10=7로 한다. 10, 1, 0.1 mL일 때에는 70/100=0.7로 한다.

시험용액 접종량	0.1 mL	0.01 mL	0.001 mL	MPN
가스발생양성관수	5 개	2 개	1 개	70

시험용액 접종이 4단계 이상으로 행하여졌을 때에는 다음 표와 같이 취급한다.

예 I, II : 5개 양성을 표시한 최소 접종량부터 시작한다.

예 III : 양성을 인정한 접종량을 중간으로 한다.

예 IV : 최소 유효 접종량 보다 1단계 적은 접종량에서 양성을 인정한 때에는 양성을 인정한 수를 최소유효 접종량의 양성관 수에 더한다(0.001 mL 단계의 양성관의 수를 0.01단계의 양성관의 수에 더함)

예	가스발생 양성관수				유효숫자
	1 mL	0.1 mL	0.01 mL	0.001 mL	1 mL	0.1 mL	0.01 mL	0.001 mL
I	5	5	2	0	-	5	2	0
II	5	4	3	0	5	4	3	-
III	0	1	0	0	0	1	0	-
IV	5	3	1	1	5	3	2	-

1) 유당배지법

4.3 제조법에 따른 연속한 3단계 이상의 희석시료(10, 1, 0.1 또는 1, 0.1, 0.01 또는 0.1, 0.01, 0.001)를 5개 또는 3개씩의 유당배지(배지 2)에 접종한다. 단, 10 mL를 접종할 때에는 2배 농도 유당 배지를 사용하고 0.1 mL 이하를 접종할 필요가 있을 때에는 10배 희석단계액을 각각 1 mL씩 사용한다. 시험용액을 가하지 아니한 동일 희석액을 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다. 가스발생 발효관 각각에 대하여 추정, 확정, 완전시험을 행하고 대장균군의 유무를 확인한 다음 최확수표로부터 검체 1 mL 또는 1 g중의 대장균군수를 구한다. 이때 시험용액을 가한 배지의 전부 또는 대부분에서 가스발생이 인정되거나 또 최소량을 가한 배지의 전부 또는 대부분이 가스가 발생되지 않도록 접종량과 희석도를 고려하여야 한다

2) BGLB배지법

4.3 제조법에 따른 연속한 3단계 이상의 희석시료(10, 1, 0.1 또는 1, 0.1, 0.01 또는 0.1, 0.01, 0.001)를 5개 또는 3개씩 BGLB 배지(배지 3)에 각각 접종한다. 단, 10 mL를 접종할 때에는 2배 농도 BGLB 배지를 사용하고 0.1 mL 이하를 접종할 필요가 있을 때에는 10배 희석단계액을 각각 1 mL씩 사용한다. 시험용액을 가하지 아니한 동일 희석액을 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다. 이때 시험용액을 가한 배지의 전부 또는 대부분에서 가스발생이 인정되거나 또 최소량을 가한 배지의 전부 또는 대부분이 가스가 발생되지 않도록 접종량과 희석도를 고려하여야 한다. 이하의 조작은 각 발효관에 대하여 BGLB 배지에 의한 정성시험법에 따라 하고 대장균군의 유무를 확인한 다음 최확수표로부터 검체 1 mL 또는 1 g중의 대장균군수를 산출한다.

나. 데스옥시콜레이트유당한천배지법

4.3 제조법에 따른 시험용액 1 mL와 각 10배 단계 희석액 1 mL에 대하여 이 배지에 의한 정성시험법과 같은 조작으로 35～37℃에서 24±2시간 배양한 후 생성된 집락중 전형적인 집락 또는 의심스러운 집락에 대하여 정성시험 때와 같은 조작으로 대장균군의 유무를 결정한다. 시험용액을 가하지 아니한 동일 희석액 1 mL를 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다. 균수 산출은 4.5.1 일반세균수에 따라 한다.

다. 건조필름법

4.3 제조법에 따른 시험용액 1 mL와 각 10배 단계 희석액 1 mL를 2매 이상씩 대장균군 건조필름배지Ⅰ(배지 54) 또는 대장균군 건조필름배지Ⅱ(배지 70)에 접종한 후, 35±1℃에서 24±2시간 배양한다. 시험용액을 가하지 아니한 동일 희석액 1 mL를 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다. 대장균군 건조필름배지Ⅰ에서는 붉은 집락 중 주위에 기포를 형성한 집락수를 계산하고, 대장균군 건조필름배지Ⅱ에서는 청색 및 청녹색의 집락수를 계산하여 그 평균집락수에 희석배수를 곱하여 대장균군 수를 산출하거나 4.5.1 일반세균수에 따라 한다(검체에 따라 결과에 의심이 있을 경우 가. 최확수법 혹은 나. 데스옥시콜레이트유당한천배지법을 사용하여야 한다).

라. 자동화된 최확수법(Automated MPN)

우유류, 유당분해우유, 가공유(무지유고형분 5.5%미만인 제품 제외), 발효유류, 가공치즈, 조제유류, 분유류, 건조저장육류, 식육추출가공품, 알가열제품 검사에 한한다.

4.8 대장균

대장균의 시험법에는 최확수법 및 건조필름법에 의한 정량시험과 일정한 한도까지 균수를 정성으로 측정하는 한도시험법이 있다.

4.8.1 정성시험

가. 한도시험

4.3 제조법에 따른 시험용액 1 mL를 3개의 EC 배지에 접종하고 44±1℃에서 24±2시간 배양 후 가스발생을 인정한 발효관은 추정시험 양성으로 하고 가스발생이 인정되지 않을 때에는 추정시험 음성으로 한다. 시험용액을 가하지 아니한 동일 희석액 1 mL를 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다.

추정시험이 양성일 때에는 해당 EC 발효관으로부터 EMB 한천배지(배지 6)에 접종하여 35～37℃에서 24±2시간 배양한 후 전형적인 집락을 보통한천배지(배지 8) 또는 Tryptic Soy 한천배지(배지 40)에 접종하여 35∼37℃에서 24±2시간 배양한다. 보통한천배지 또는 Tryptic Soy 한천배지에서 배양된 집락을 취하여 그람염색을 실시하여 그람음성, 무아포성 간균을 확인한 후 IMViC시험(Indole test, Methyl red test, VP test, Citrate test)등 생화학 시험을실시하여 대장균 양성으로 판정한다.

4.8.2 정량시험

가. 최확수법

1) 제1법

4.3 제조법에 따른 연속한 3단계 이상의 희석시료(10, 1, 0.1 또는 1, 0.1, 0.01 또는 0.1, 0.01, 0.001)를 각각 5개 또는 3개의 EC 배지(배지 10) 발효관에 접종한 다음 44.±1℃에서 24±2시간 배양한다. 단, 10 mL를 접종할 때에는 2배 농도 EC 배지를 사용하고 0.1 mL 이하를 접종할 필요가 있을 때에는 10배 희석단계액을 각각 1 mL씩 사용한다.  시험용액을 가하지 아니한 동일 희석액을 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다. 가스발생을 인정한 발효관에 대하여 4.8.1 정성시험 가. 한도시험에서 추정시험 양성일 때와 같이 행하여 대장균의 유무를 확인한 다음 별표 1 또는 별표 2 최확수표로부터 검체 1 mL 또는 1 g 중의 대장균수를 산출한다.

2) 제2법 (패각)

(1) 시험용액의 제조

패각을 제거한 검체 200 g에 0.1% peptone solution(시액 9) 200mL을 첨가하여 분쇄한 후 분쇄액 20 mL과 동일한 희석액(시액 9) 80 mL을 혼합하여 최종 10배 희석한 것을 시험용액으로 사용한다. 검체를 가하지 아니한 동일 희석액을 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다. 시험용액은 필요에 따라 100배, 1,000배 등으로 희석하여 사용할 수 있다.

(2) 추정시험

제조법에 따른 시험용액 10 mL을 5개의 2배 농도 MMGM 배지(배지 72)가 들어있는 시험관에 접종하고, 또 시험용액 1 mL 및 0.1 mL을 각각 5개의 MMGM 배지가 들어있는 시험관에 접종하여 37±1℃에서 24±2시간 배양한다. 배양 결과 시험관내의 배지의 색깔이 노란색으로 되었을 때 추정시험 양성으로 하며 확정시험을 실시한다.

(3) 확정시험

추정시험에서 양성으로 확인된 MMGM 시험관 배양액을 BCIG 한천배지(배지 73)에 분리 배양한다. 44±1℃에서 24±2시간 배양 후 청녹색의(blue-green) 전형적인 집락이 발생되면 대장균(E. coli) 양성이라고 판정하고 별표 1 최확수표에 따라 검체 100 g중의 대장균수를 산출한다.

3) 제3법 (유가공품·식육가공품·알가공품)

가) 최확수법

최확수법(3개 또는 5개 시험관을 이용한 MPN법)으로 대장균군수 검사에서 사용한 BGLB배지에서 가스생성 양성인 시험관으로부터 EC-MUG배지(또는 BGLB-MUG, LST-MUG)에 접종하여 44±1℃에서 24±2시간 배양한 후 자외선 조사하에 푸른 형광이 관찰되는 시험관을 대장균 양성으로 판정하고 최확수표 (별표 1 또는 별표 2)에 근거하여 대장균수를 산출한다.

나) 대장균 확인시험

최확수법에서 가스생성과 형광이 관찰된 것은 대장균 추정시험 양성으로 판정하고 대장균의 확인시험은 추정시험 양성으로 판정된 시험관으로부터 EMB 한천배지(배지6) 또는 MacConkey 한천배지(배지30)에 접종하여 37℃에서 24시간 배양하여 전형적인 집락을 관찰하고 그람염색, MUG시험, IMViC시험 등을 검사하여 최종확인한다. 대장균은 MUG시험에서 형광이 관찰되며, 가스생성, 그람음성의 무아포간균이며, IMViC시험에서 “ + + - - ”의 결과를 나타내는 것은 대장균(E. coli) biotype 1로 규정한다.

나. 건조필름법

4.3 제조법에 따른 시험용액 1 mL와 각 단계 희석액 1 mL를 2매 이상씩 대장균 건조필름배지Ⅰ(배지 55) 또는 대장균 건조필름배지Ⅱ(배지 71)에 접종한 후, 35±1℃에서 24∼48시간 배양한다. 시험용액을 가하지 아니한 동일 희석액 1 mL를 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다. 대장균 건조필름배지Ⅰ에서는 푸른 집락 중 주위에 기포를 형성한 집락수를 계산하고, 대장균 건조필름배지Ⅱ에서는 남색 및 보라색의 집락수를 계산하여 그 평균집락수에 희석배수를 곱하여 대장균 수를 산출하거나 4.5.1 일반세균수에 따라 한다(검체에 따라 결과에 의심이 있을 경우 최확수법을 사용하여야 한다).

다. 자동화된 최확수법(Automated MPN)

치즈, 식육추출가공품, 닭도체, 오리도체에 한한다.

별표 1. 3단계희석 시험관 5개씩 시험하였을 때 양성에 대한 최확수(95%의 신뢰한계)

양성시험관수 0.1 0.01 0.001	MPN/ g(mL)	양성시험관수 0.1 0.01 0.001	MPN/ g(mL)	양성시험관수 0.1 0.01 0.001	MPN/ g(mL)	양성시험관수 0.1 0.01 0.001	MPN/ g(mL)	양성시험관수 0.1 0.01 0.001	MPN/ g(mL)	양성시험관수 0.1 0.01 0.001	MPN/ g(mL)
0 0 0 0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 2 0 0 2 1 0 2 2 0 2 3 0 2 4 0 2 5 0 3 0 0 3 1 0 3 2 0 3 3 0 3 4 0 3 5 0 4 0 0 4 1 0 4 2 0 4 3 0 4 4 0 4 5 0 5 0 0 5 1 0 5 2 0 5 3 0 5 4 0 5 5	<1.8 1.8 3.6 5.4 7.2 9 1.8 3.6 5.5 7.3 9.1 11 3.7 5.5 7.4 9.2 11 13 5.6 7.4 9.3 11 13 15 7.5 9.4 11 13 15 17 9.5 11 13 15 17 19	1 0 0 1 0 1 1 0 2 1 0 3 1 0 4 1 0 5 1 1 0 1 1 1 1 1 2 1 1 3 1 1 4 1 1 5 1 2 0 1 2 1 1 2 2 1 2 3 1 2 4 1 2 5 1 3 0 1 3 1 1 3 2 1 3 3 1 3 4 1 3 5 1 4 0 1 4 1 1 4 2 1 4 3 1 4 4 1 4 5 1 5 0 1 5 1 1 5 2 1 5 3 1 5 4 1 5 5	2 4 6 8 10 12 4 6.1 8.1 10 12 14 6.1 8.2 10 12 15 17 8.3 10 13 15 17 19 11 13 15 17 19 22 13 15 17 19 22 24	2 0 0 2 0 1 2 0 2 2 0 3 2 0 4 2 0 5 2 1 0 2 1 1 2 1 2 2 1 3 2 1 4 2 1 5 2 2 0 2 2 1 2 2 2 2 2 3 2 2 4 2 2 5 2 3 0 2 3 1 2 3 2 2 3 3 2 3 4 2 3 5 2 4 0 2 4 1 2 4 2 2 4 3 2 4 4 2 4 5 2 5 0 2 5 1 2 5 2 2 5 3 2 5 4 2 5 5	4.5 6.8 9.1 12 14 16 6.8 9.2 12 14 17 19 9.3 12 14 17 19 22 12 14 17 20 22 25 15 17 20 23 25 28 17 20 23 26 29 32	3 0 0 3 0 1 3 0 2 3 0 3 3 0 4 3 0 5 3 1 0 3 1 1 3 1 2 3 1 3 3 1 4 3 1 5 3 2 0 3 2 1 3 2 2 3 2 3 3 2 4 3 2 5 3 3 0 3 3 1 3 3 2 3 3 3 3 3 4 3 3 5 3 4 0 3 4 1 3 4 2 3 4 3 3 4 4 3 4 5 3 5 0 3 5 1 3 5 2 3 5 3 3 5 4 3 5 5	7.8 11 13 16 20 23 11 14 17 20 23 27 14 17 20 24 27 31 17 21 24 28 31 35 21 24 28 32 36 40 25 29 32 37 41 45	4 0 0 4 0 1 4 0 2 4 0 3 4 0 4 4 0 5 4 1 0 4 1 1 4 1 2 4 1 3 4 1 4 4 1 5 4 2 0 4 2 1 4 2 2 4 2 3 4 2 4 4 2 5 4 3 0 4 3 1 4 3 2 4 3 3 4 3 4 4 3 5 4 4 0 4 4 1 4 4 2 4 4 3 4 4 4 4 4 5 4 5 0 4 5 1 4 5 2 4 5 3 4 5 4 4 5 5	13 17 21 25 30 36 17 21 26 31 36 42 22 26 32 38 44 50 27 33 39 45 52 59 34 40 47 54 62 69 41 48 56 64 72 81	5 0 0 5 0 1 5 0 2 5 0 3 5 0 4 5 0 5 5 1 0 5 1 1 5 1 2 5 1 3 5 1 4 5 1 5 5 2 0 5 2 1 5 2 2 5 2 3 5 2 4 5 2 5 5 3 0 5 3 1 5 3 2 5 3 3 5 3 4 5 3 5 5 4 0 5 4 1 5 4 2 5 4 3 5 4 4 5 4 5 5 5 0 5 5 1 5 5 2 5 5 3 5 5 4 5 5 5	23 31 43 58 76 95 33 46 63 84 110 130 49 70 94 120 150 180 79 110 140 180 210 250 130 170 220 280 350 430 240 350 540 920 1,600 >1,600

양성시험관수 10, 1, 0.1	MPN/ 100mL	양성시험관수 10, 1, 0.1	MPN/ 100mL	양성시험관수 10, 1, 0.1	MPN/ 100mL	양성시험관수 10, 1, 0.1	MPN/ 100mL	양성시험관수 10, 1, 0.1	MPN/ 100mL	양성시험관수 10, 1, 0.1	MPN/ 100mL
0 0 0 0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 2 0 0 2 1 0 2 2 0 2 3 0 2 4 0 2 5 0 3 0 0 3 1 0 3 2 0 3 3 0 3 4 0 3 5 0 4 0 0 4 1 0 4 2 0 4 3 0 4 4 0 4 5 0 5 0 0 5 1 0 5 2 0 5 3 0 5 4 0 5 5	<1.8 1.8 3.6 5.4 7.2 9 1.8 3.6 5.5 7.3 9.1 11 3.7 5.5 7.4 9.2 11 13 5.6 7.4 9.3 11 13 15 7.5 9.4 11 13 15 17 9.5 11 13 15 17 19	1 0 0 1 0 1 1 0 2 1 0 3 1 0 4 1 0 5 1 1 0 1 1 1 1 1 2 1 1 3 1 1 4 1 1 5 1 2 0 1 2 1 1 2 2 1 2 3 1 2 4 1 2 5 1 3 0 1 3 1 1 3 2 1 3 3 1 3 4 1 3 5 1 4 0 1 4 1 1 4 2 1 4 3 1 4 4 1 4 5 1 5 0 1 5 1 1 5 2 1 5 3 1 5 4 1 5 5	2 4 6 8 10 12 4 6.1 8.1 10 12 14 6.1 8.2 10 12 15 17 8.3 10 13 15 17 19 11 13 15 17 19 22 13 15 17 19 22 24	2 0 0 2 0 1 2 0 2 2 0 3 2 0 4 2 0 5 2 1 0 2 1 1 2 1 2 2 1 3 2 1 4 2 1 5 2 2 0 2 2 1 2 2 2 2 2 3 2 2 4 2 2 5 2 3 0 2 3 1 2 3 2 2 3 3 2 3 4 2 3 5 2 4 0 2 4 1 2 4 2 2 4 3 2 4 4 2 4 5 2 5 0 2 5 1 2 5 2 2 5 3 2 5 4 2 5 5	4.5 6.8 9.1 12 14 16 6.8 9.2 12 14 17 19 9.3 12 14 17 19 22 12 14 17 20 22 25 15 17 20 23 25 28 17 20 23 26 29 32	3 0 0 3 0 1 3 0 2 3 0 3 3 0 4 3 0 5 3 1 0 3 1 1 3 1 2 3 1 3 3 1 4 3 1 5 3 2 0 3 2 1 3 2 2 3 2 3 3 2 4 3 2 5 3 3 0 3 3 1 3 3 2 3 3 3 3 3 4 3 3 5 3 4 0 3 4 1 3 4 2 3 4 3 3 4 4 3 4 5 3 5 0 3 5 1 3 5 2 3 5 3 3 5 4 3 5 5	7.8 11 13 16 20 23 11 14 17 20 23 27 14 17 20 24 27 31 17 21 24 28 31 35 21 24 28 32 36 40 25 29 32 37 41 45	4 0 0 4 0 1 4 0 2 4 0 3 4 0 4 4 0 5 4 1 0 4 1 1 4 1 2 4 1 3 4 1 4 4 1 5 4 2 0 4 2 1 4 2 2 4 2 3 4 2 4 4 2 5 4 3 0 4 3 1 4 3 2 4 3 3 4 3 4 4 3 5 4 4 0 4 4 1 4 4 2 4 4 3 4 4 4 4 4 5 4 5 0 4 5 1 4 5 2 4 5 3 4 5 4 4 5 5	13 17 21 25 30 36 17 21 26 31 36 42 22 26 32 38 44 50 27 33 39 45 52 59 34 40 47 54 62 69 41 48 56 64 72 81	5 0 0 5 0 1 5 0 2 5 0 3 5 0 4 5 0 5 5 1 0 5 1 1 5 1 2 5 1 3 5 1 4 5 1 5 5 2 0 5 2 1 5 2 2 5 2 3 5 2 4 5 2 5 5 3 0 5 3 1 5 3 2 5 3 3 5 3 4 5 3 5 5 4 0 5 4 1 5 4 2 5 4 3 5 4 4 5 4 5 5 5 0 5 5 1 5 5 2 5 5 3 5 5 4 5 5 5	23 31 43 58 76 95 33 46 63 84 110 130 49 70 94 120 150 180 79 110 140 180 210 250 130 170 220 280 350 430 240 350 540 920 1,600 >1,600

※ 최확수법을 이용한 판정 시 양성 시험관수가 모두 0인 경우 결과값은 0으로 간주한다.

별표 2. 3단계희석 시험관 3개씩 시험하였을 때 양성에 대한 최확수(95%의 신뢰한계)

양성시험관수	MPN/g(mL)	양성시험관수	MPN/g(mL)
0.1 0.01 0.001		0.1 0.01 0.001
0 0 0 0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 2 0 0 2 1 0 2 2 0 2 3 0 3 0 0 3 1 0 3 2 0 3 3 1 0 0 1 0 1 1 0 2 1 0 3 1 1 0 1 1 1 1 1 2 1 1 3 1 2 0 1 2 1 1 2 2 1 2 3 1 3 0 1 3 1 1 3 2 1 3 3	<3 3 6 9 3 6.1 9.2 12 6.2 9.3 12 16 9.4 13 16 19 3.6 7.2 11 15 7.4 11 15 19 11 15 20 24 16 20 24 29	2 0 0 2 0 1 2 0 2 2 0 3 2 1 0 2 1 1 2 1 2 2 1 3 2 2 0 2 2 1 2 2 2 2 2 3 2 3 0 2 3 1 2 3 2 2 3 3 3 0 0 3 0 1 3 0 2 3 0 3 3 1 0 3 1 1 3 1 2 3 1 3 3 2 0 3 2 1 3 2 2 3 2 3 3 3 0 3 3 1 3 3 2 3 3 3	9.2 14 20 26 15 20 27 34 21 28 35 42 29 36 44 53 23 38 64 95 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 >1,100

양성시험관수	MPN/100(mL)	양성시험관수	MPN/100(mL)
10 1 0.1		10 1 0.1
0 0 0 0 0 1 0 0 2 0 0 3 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 2 0 0 2 1 0 2 2 0 2 3 0 3 0 0 3 1 0 3 2 0 3 3 1 0 0 1 0 1 1 0 2 1 0 3 1 1 0 1 1 1 1 1 2 1 1 3 1 2 0 1 2 1 1 2 2 1 2 3 1 3 0 1 3 1 1 3 2 1 3 3	<3 3 6 9 3 6.1 9.2 12 6.2 9.3 12 16 9.4 13 16 19 3.6 7.2 11 15 7.4 11 15 19 11 15 20 24 16 20 24 29	2 0 0 2 0 1 2 0 2 2 0 3 2 1 0 2 1 1 2 1 2 2 1 3 2 2 0 2 2 1 2 2 2 2 2 3 2 3 0 2 3 1 2 3 2 2 3 3 3 0 0 3 0 1 3 0 2 3 0 3 3 1 0 3 1 1 3 1 2 3 1 3 3 2 0 3 2 1 3 2 2 3 2 3 3 3 0 3 3 1 3 3 2 3 3 3	9.2 14 20 26 15 20 27 34 21 28 35 42 29 36 44 53 23 38 64 95 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 >1,100

※ 최확수법을 이용한 판정 시 양성 시험관수가 모두 0인 경우 결과값은 0으로 간주한다.

4.9 유산균수

4.9.1 유산균수

유산균수 측정방법은 MRS 배지(배지 87), BL 한천배지(배지 15) 또는 BCP첨가 평판측정용배지 (배지 11)를 사용하여 유산균의 집락을 계수한다. 시험용액 제조 희석액은 멸균생리식염수(시액 2) 또는 펩톤식염완충액(시액 7)을 사용한다. 검사시료 10〜25 g(mL)에 9배 희석액을 가하여 100〜250 mL가 되게 하고 균질화한다 (10-1용액). 시험용액(10-1용액) 1 mL에 희석액을 가하여 10 mL가 되게 하고 10-2시험용액을 만든 후 동일하게 조작하여 희석한다.

MRS 배지(배지 87)와 BCP첨가 평판측정용배지(배지 11)는 일반세균수의 표준평판법에 준하여 시험하고, BL 한천배지(배지 15)는 각 희석 시험용액 0.1 mL씩을 BL한천배지(배지 15) 2매 이상에 접종하여 멸균초자봉으로 도말한다. 시료가 접종된 페트리디쉬는 35〜37℃에서 48〜72±3시간 혐기배양(발효유류의 경우 호기 배양 가능)한다. 배양 후 생성된 집락수를 측정하고 희석배수를 곱하여 검사시료 g(mL)당 균수를 산출한다. 다만, 유산균의 종류 등에 따른 배지 특이성을 고려하여 교차 확인 후 최종값을 산출할 수 있다. 모든 시험에서는 시험용액을 가하지 아니한 동일 희석액을 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다.

4.9.2 유산간·구균 및 비피더스균

이 시험법은 유산간·구균 단순첨가(함유)제품(과자류, 코코아가공품류 또는 초콜릿류, 기타음료, 우유류, 아이스크림류 등)이거나 유산간·구균과 비피더스균을 구분하여 산정해야 하는 경우에 한한다.

유산간·구균은 BCP첨가 평판측정용배지(배지 11)를 사용하고, 비피더스균은 TOS-MUP 배지(배지 25)를 사용한 시험방법에 따라 시험한 후 산출한다.

BCP첨가 평판측정용 배지(배지 11)를 사용하는 경우, 일반세균수의 표준평판법에 준하여 시험하며, 35〜37℃에서 48〜72±3시간 호기 또는 혐기 배양한 후 발생한 황색의 집락을 유산균으로 계수한다. TOS-MUP 배지(배지 25)를 사용하는 경우, 일반세균수의 표준평판법에 준하여 시험하고, 35〜37℃에서 48〜72±3시간 혐기 배양한다. 모든 시험에서는 시험용액을 가하지 아니한 동일 희석액 0.1 mL를 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다.

4.10 진균수(효모 및 사상균수)

진균수의 측정방법은 포테이토 덱스트로오즈 한천배지(배지 12), DRBC 한천배지(배지 102) 또는 DG18 한천배지(배지 103)를 사용하여 진균의 집락을 계수한다. 4.3 제조법에 따른 시험용액을 적절한 단계로 희석하여 시험용액과 각 단계 희석액 0.1 mL 씩을 한천배지 2매 이상에 접종하여 도말한다. 25℃에서 3일간 배양한 후 발생한 집락수를 계산하고, 집락이 없거나 집락이 너무 작아 판정이 어려운 경우 2일 이내의 기간 동안 추가 배양한다. 검액을 가하지 아니한 동일 희석액 0.1 mL를 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다. 집락수의 계산은 1개의 평판당 10개～150개의 집락을 생성한 평판을 택하여 계산하는 것을 원칙으로 하며, 전 평판에 10개 미만의 집락을 얻었을 경우에는 가장 희석수가 낮은 것을 측정한다. 평균집락수를 산출하고, 이에 희석배수를 곱하여 진균수로 한다. 숫자는 높은 단위로부터 3단계에서 반올림하여 유효숫자를 2단계로 끊어 이하를 0으로 한다.

4.11 살모넬라(Salmonella spp.)

가. 증균배양

1) 식품 및 식육：시료 25 mL(g)에 225 mL의 펩톤식염완충액(Buffered Peptone Water, 시액 7)을 첨가하여 36±1℃에서 18～24시간 배양한 후 이 배양액을 2종류의 증균배지, 즉 10 mL의 Tetrathionate 배지(배지 88)에 1 mL를 첨가함과 동시에 10 mL의 RV 배지(배지 57) 또는 RVS 배지(배지 89)에 0.1 mL를 첨가하여 각각 36±1℃(Tetrathionate 배지) 및 41.5±1℃(RV 배지 또는 RVS 배지)에서 20～24시간 동안 증균배양한다. 시료를 가하지 아니한 동일 펩톤식염완충액을 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다.

2) 소, 돼지도체：제8. 일반시험법 5. 원유·식육·식용란의 시험법 5.2. 식육 시험법 5.2.3. 세균학적 시험법 가. 시료채취 및 방법 1) 도체 가)소 및 나)돼지의 시료채취 방법에 따라 멸균가아제나 스폰지로 시료를 채취한 후 멸균백에 넣고 최종용량이 40 mL 되게 BPW를 넣은 다음 균질화 시킨 후 36±1℃에서 18～24시간 배양한다. 시료를 채취하지 않은 동일 멸균가아제나 스폰지로 대조시험액을 제조하고 함께 시험하여 시험조작의 무균여부를 확인한다. 1차 배양액은 1) 식품 및 식육의 2차 증균과정을 따라 증균시킨다.

3) 닭, 오리도체：제8. 일반시험법 5. 원유·식육·식용란의 시험법 5.2. 식육 시험법 5.2.3. 세균학적 시험법 가. 시료채취 및 방법 1) 도체 다)닭의 시료 채취방법에 따라 채취한 시료 30 mL을 취하여 30 mL BPW에 넣은 다음 균질화 시키고 36±1℃에서 18～24시간 배양한다. 시료 채취 시 사용한 동일 BPW 또는 BPD를 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다. 1차 배양액은 1) 식품 및 식육의 2차 증균과정을 따라 증균시킨다.

4) 식용란：식용란 20개를 채취하여 제8. 일반시험법 5. 원유·식육·식용란의 시험법 5.3. 식용란의 시험법 5.3.3. 세균학적 시험법 가. 시료채취 및 조제에 따라 소독 한 후 말린 식용란을 깨서 4L 용량의 멸균비커 또는 멸균비닐백 등 적정한 용량의 멸균용기에 넣어서 준비한 다음(달걀을 깰 때는 위생장갑을 껴야하며 샘플마다 위생장갑을 바꾸어준다.) 멸균 도구 등을 이용하여 난황과 난백이 섞이도록 균질화를 시킨다. 준비된 시료에 2L의 멸균 TSB를 섞어 35℃에서 24±2시간 동안 증균한다. 시료를 넣지 않은 멸균 TSB를 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다. 1차 배양액은 1) 식품 및 식육의 2차 증균과정을 따라 증균시킨다.

나. 분리배양

각각의 증균배양액을 XLD Agar(배지 58)와 동시에 BG Sulfa 한천배지(배지 90), Bismuth Sulfite 한천배지(배지 64), Desoxycholate Citrate 한천배지(배지 31), HE 한천배지(배지 91) 또는 XLT4 한천배지(배지 92)에 도말한 후 36±1℃에서 20～24시간 배양한다. 의심집락은 5개 이상 취하여 확인시험을 실시한다.

다. 확인시험

1) 생화학적 확인시험

의심스러운 집락에 대해 TSI Agar(배지 32) 또는 LIA 사면배지(배지 93)에 천자하여 37±1℃에서 20～24시간 배양한다. TSI 및 LIA 검사결과 살모넬라균으로 추정되는 균에 대해서는 그람음성의 간균임을 확인하고, Indol(-), MR(+), VP(-), Citrate(+), Urease(-), Lysine(+), KCN(-), malonate(-) 시험등의 생화학적 검사를 실시하여 살모넬라 양성유무를 판정한다.

2) 응집시험

균종 확인이 필요한 경우 살모넬라진단용 항혈청을 사용한 응집반응 결과에 따라 균종을 결정한다. 먼저 살모넬라 O혼합혈청 시험으로서 다가 O항혈청을 사용하여 슬라이드 응집반응검사를 실시한 후 살모넬라 O인자 혈청시험 즉 A, B, C, D, E군 등의 인자 항혈청으로 슬라이드 응집반응을 실시하여 O혈청형을 결정한다. H인자 혈청시험은 편모(H)항혈청 즉 a, b, c, d, e, h, g, k, l , r, y, 1.2, 1.3, 1.5, 1.6 등에 대해 시험관 응집반응을 실시하여 결정한다.

4.12 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)

4.12.1 정성시험

가. 증균배양

검체 25 g 또는 25 mL를 취하여 225 mL의 10% NaCl을 첨가한 TSB 배지(배지 23)에 가한 후 35∼37℃에서 18∼24시간 증균배양한다. 검체를 가하지 아니한 10% NaCl을 첨가한 동일 TSB배지를 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다.

나. 분리배양

증균 배양액을 난황첨가 만니톨 식염한천배지(배지 14) 또는 Baird-Parker 한천배지(배지 63) 또는 Baird-Parker(RPF) 한천배지(배지 67)에 접종하여 35∼37℃에서 18∼24시간 배양한다. 배양결과 난황첨가만니톨 식염한천배지에서 황색불투명 집락을 나타내고 주변에 혼탁한 백색환이 있는 집락 또는 Baird-Parker 한천배지에서 투명한 띠로 둘러싸인 광택이 있는 검정색 집락 또는 Baird-Parker(RPF) 한천배지에서 불투명한 환으로 둘러싸인 검정색 집락은 확인시험을 실시한다.

다. 확인시험

분리배양된 평판배지상의 집락을 보통한천배지(배지 8) 또는 Tryptic Soy 한천배지(배지 40)에 옮겨 35～37℃에서 18～24시간 배양한 후 그람염색을 실시하여 포도상의 배열을 갖는 그람양성 구균을 확인한 후 coagulase 시험을 실시하며 24시간 이내에 응고유무를 판정한다. Baird-Parker(RPF) 한천배지에서 전형적인 집락으로 확인된 것은 coagulase 시험을 생략할 수 있다. Coagulase 양성으로 확인된 것은 생화학 시험을 실시하여 판정한다.

4.12.2 정량시험

가. 균수 측정

검체 25 g 또는 25 mL를 취한 후, 225 mL의 희석액을 가하여 2분간 고속으로 균질화하여 시험용액으로 하여 10배 단계 희석액을 만든 다음 각 단계별 희석액을  Baird-Parker 한천배지(배지 63) 3장에 0.3 mL, 0.4 mL, 0.3 mL씩 총 접종액이 1 mL이 되게 도말한다. 사용된 배지는 완전히 건조시켜 사용하고 접종액이 배지에 완전히 흡수되도록 도말한 후 10분간 실내에서 방치시킨 후 35～37℃ 에서 48±3시간 배양한 다음 투명한 띠로 둘러싸인 광택의 검정색 집락을 계수한다. 검체를 가하지 아니한 동일 희석액을 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다.

나. 확인시험

계수한 평판에서 5개 이상의 전형적인 집락을 선별하여 보통한천배지(배지 8) 또는 Tryptic Soy 한천배지(배지 40)에 접종하고 35~37℃에서 18～24시간 배양한 후 4.12.1 정성시험 다. 확인시험에 따라 시험을 실시한다.

다. 균수계산

확인 동정된 균수에 희석배수를 곱하여 계산한다. 예를 들어 10-1 희석용액을 0.3 mL, 0.3 mL, 0.4 mL씩 3장의 선택배지에 도말 배양하고, 3장의 집락을 합한 결과 100개의 전형적인 집락이 계수되었고 5개의 집락을 확인한 결과 3개의 집락이 황색포도상 구균으로 확인되었을 경우 시험용액 1 mL에는 황색포도상 구균의 수는 10 × 100 × (3/5) = 600으로 계산한다.

4.13. 장염비브리오(Vibrio parahaemolyticus)

4.13.1 정성시험

가. 증균배양

검체 25 g 또는 25 mL를 취하여 225 mL의 Alkaline 펩톤수(배지 16)를 가한 후 35～37℃에서 18～24시간 증균배양한다. 검체를 가하지 아니한 동일 Alkaline 펩톤수를 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다.

나. 분리배양

증균배양액을 TCBS 한천배지(배지 17)에 접종하여 35～37℃에서 18～24시간 배양한다. 배양결과 직경 2～4 mm인 청록색의 서당(sucrose) 비분해 집락에 대하여 확인시험을 실시한다.

다. 확인시험

분리배양된 평판배지상의 집락을 LIM 반유동배지(배지 18), 2% NaCl을 첨가한 보통한천배지(배지 8) 또는 Tryptic Soy 한천배지(배지 40)에 각각 접종한 후 35～37℃에서 18～24시간 배양한다. 배양 후 그람염색을 실시하여 그람음성 간균을 확인한다. 장염비브리오는 LIM배지에서 Lysine Decarboxylase 양성, Indole 생성, 운동성 양성이다. 장염비브리오로 추정된 균은 Oxidase시험, 0, 6, 및 10% NaCl을 포함한 Alkaline 펩톤수(배지 16)에 의한 내염성시험, Arginine 분해시험(배지 21, 1% Arginine 첨가), ONPG(배지 22)시험을 실시한다. 장염비브리오는 0% 및 10% NaCl 포함한 배지에서 발육 음성, 6% NaCl을 포함한 배지에서는 발육 양성, Arginine 분해 음성, ONPG 시험 음성이다

4.13.2 정량시험

가. 균수측정

검체 25 g 또는 25 mL를 취한 후, 225 mL의 희석액을 가하여 2분간 고속으로 균질화하여 시험용액으로 하여 10배 단계 희석액을 만든 다음 각 단계별 희석액을 TCBS 한천배지(배지 17) 3장에 0.3 mL, 0.4 mL, 0.3 mL씩 총 접종액이 1 mL이 되게 도말한다. 검체를 가하지 아니한 동일 희석액을 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다. 사용된 배지는 완전히 건조시켜 사용하고 접종액이 배지에 완전히 흡수되도록 도말한 후 10분간 실내에서 방치시킨 후 35～37℃ 에서 18～24시간 배양한 다음 청록색의 서당(sucrose) 비분해 집락을 계수한다.

나. 확인시험

계수한 평판에서 5개 이상의 전형적인 집락을 선별하여 2% NaCl을 첨가한 보통한천배지(배지 8) 또는 Tryptic Soy 한천배지(배지 40)에 접종하고 35～37℃에서 18～24시간 배양한 후 4.13.1 정성시험 다. 확인시험에 따라 시험을 실시한다.

다. 균수계산

확인 동정된 균수에 희석배수를 곱하여 계산한다. 예를들어 10-1 희석용액을 0.3 mL, 0.3 mL, 0.4 mL씩 3장의 선택배지에 도말 배양하고, 3장의 집락을 합한 결과 50개의 전형적인 집락이 계수되었고 5개의 집락을 확인한 결과 4개의 집락이 장염비브리오로 동정되었을 경우 시험용액 1mL에 장염비브리오의 수는 50 × (4/5) × 10 = 400으로 계산한다.

4.14 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)

4.14.1 정성시험

가. 증균배양

4.3 제조법에 따른 시험용액 1 mL를 Cooked Meat 배지(배지 33)의 아랫부분에 접종하여 35～37℃에서 18～24시간 동안 혐기배양한다. 시험용액을 가하지 아니한 동일 희석액 1 mL를 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다.

나. 분리배양

Clostridium perfringens 한천배지(배지 27) 또는 TSC 한천배지(배지 41)에 증균배양액을 접종하여 35∼37℃에서 18～24시간 혐기배양한 결과 Clostridium perfringens 한천배지에서 직경 2mm 정도의 약간 돌기된 유황색으로 주변에 불투명한 백색환이 있는 집락 또는 TSC 한천배지에서 불투명한 환을 가지는 황회색 집락은 확인시험을 실시한다.

다. 확인시험

분리배양된 평판배지상의 집락을 보통한천배지(배지 8) 또는 Tryptic Soy 한천배지(배지 40)에 옮겨 35∼37℃에서 18～24시간 혐기배양한 후 그람염색을 실시한다. 또 동시에 보통한천배지 또는 Tryptic Soy 한천배지를 35∼37℃에서 18～24시간 호기 배양하여 균의 비발육을 확인한다. 그람양성간균으로 확인된 집락은 glucose, lactose, inositol, raffinose를 1% 가한 4종의 GAM 배지(배지 34)에 옮겨 35∼37℃에서 3일간 배양 후 BTB-MR지시약(시액 4)을 가해서 붉은 색으로 변하는 것을 양성으로 판정한다. 운동성은 GAM 배지(배지 34)에서 35∼37℃에서 1～2일간 배양하여 운동성의 유무를 관찰한다. Glucose, lactose, inositol과 raffinose를 분해하며 운동성이 없는 것을 확인하면 Lecithinase 억제시험을 실시한다. TSC한천배지(배지 41)에 접종하여 35∼37℃에서 24시간 혐기배양한 후 2～4 mm의 불투명한 환을 가지는 황회색 집락을 양성으로 판정한다.

4.14.2 정량시험

가. 균수 측정

검체 25 g 또는 25 mL를 취하여 225 mL의 희석액을 가한 후 1∼2분간 저속으로 균질화 한 후 10배 단계 희석액을 만든다. 시험용액 및 단계별 희석액 1 mL씩을 2매 이상의 멸균 페트리접시에 무균적으로 분주하고, 43～45℃로 유지한 TSC 한천배지(배지 41) 10∼15 mL를 가하여 좌우로 돌리면서 잘 혼합한 후 응고시킨다. 응고된 배지 위에 다시 동일한 배지 10 mL를 가하여 중첩시킨 후 35∼37℃에서 24±2 시간 혐기 배양한다. 검체를 가하지 아니한 동일 희석액 1mL을 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다. 150개 이하의 전형적인 검은색 집락이 확인된 평판을 선별하여 각 집락수를 계수한다.

나. 확인시험

계수한 평판에서 5개 이상의 전형적인 집락을 선별하여 보통한천배지(배지 8) 또는 Tryptic Soy 한천배지(배지 40)에 접종하고 35∼37℃ 에서 18∼24 시간 혐기배양한 후 4.14.1 정성시험 다. 확인시험에 따라 실시한다.

다. 균수계산

확인 동정된 균수에 희석배수를 곱하여 계산한다. 예로 10-4에서 평균집락수가 85개이었고, 이 중 5개의 집락을 확인한 결과 4개의 집락이 클로스트리디움 퍼프린젠스로 동정되었을 경우 85 × (4/5) × 10,000 = 680,000으로 계산한다.

4.15 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)

가. 증균배양

가공식품 및 수산물에 대해서는 증균배지로 Listeria 증균배지(배지 35)를 사용하며, 검체 25 g(mL)를 취하여 225 mL의 Listeria 증균배지를 가한 후 30℃에서 48시간 배양한다. 유가공품류(유함유가공품 제외), 식육가공품, 알가공품류(알함유가공품 제외), 식육 및 가금류는 25g(mL)을 Listeria 증균배지(배지 35), PALCAM 배지(배지 105), UVM-modified Listeria 증균배지(배지 36) 또는 Half Fraser 배지(배지 104) 225 mL에 접종하여 30℃에서 24±2시간 동안 증균 배양한 후, 배양액 0.1 mL을 10 mL의 Fraser 배지(배지 37)에 접종하여 35∼37℃에서 24∼48시간 2차 증균을 실시한다. 모든 시험에서는 검체를 가하지 아니한 동일 증균배지를 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다.

나. 분리배양

증균배양액을 Oxford 한천배지(배지 38) 또는 LPM 한천배지(배지 39) 또는 PALCAM 한천배지(배지 65) 또는 ALOA 한천배지(배지 100)에 접종하여 35〜37℃에서 24～48시간 배양한다. 의심집락이 확인되면 이를 0.6% yeast extract가 포함된 Tryptic soy 한천배지(배지 40)에 접종하여 30℃에서 24～48시간 배양한다.

다. 확인시험

그람염색 후 그람양성 간균이 확인되면 hemolysis, motility, catalase, mannitol, rhamnose, xylose의 당분해시험, Phosphatidylinositol phospholipase C(PI-PLC) 반응시험을 실시한다. 이 결과 β-hemolysis를 나타내고 catalase 양성, motility 양성을 나타내며, 당분해시험 결과 mannitol 비분해, rhamnose 분해, xylose 비분해, PI-PLC 반응시험 시 집락 주위에 불투명한 환이 보일 경우 Listeria monocytogenes 양성으로 판정한다 (단, 분리배양 시 ALOA 한천배지를 사용한 경우, PI-PLC 반응시험을 생략할 수 있다). Hemolysis에 대한 부가 시험으로 CAMP test를 할 수 있으며, 그 결과 Staphylococcus aureus(ATCC 25923)에서 양성, Rhodococcus equi(ATCC 6939)에서 음성으로 나타나는 경우 Listeria monocytogenes 양성으로 판정한다.

4.16 장출혈성 대장균

본 시험법은 대장균 O157:H7과 대장균 O157:H7이 아닌 시가독소(동의어: 베로독소) 생성 대장균(STEC, Shiga toxin producing E.coli)을 모두 검출하는 시험법이다. 장출혈성 대장균의 낮은 최소 감염량을 고려하여 검출 민감도 증가와 신속 검사를 위한 스크리닝 목적으로 증균 배양 후 배양액(1～2 mL)을 취한 후, 10분간 끓여 원심분리하고, 상등액 10～20 μL를 취하여 시료로 사용한다(단, 유전자 추출방법은 상기의 방법과 동등 이상인 유전자 추출키트, 장비 등을 사용할 수 있다). 추출한 유전자를 이용하여 시가독소 유전자 확인시험을 우선 실시한다. 시가독소(stx1 그리고/또는 stx2) 유전자가 확인되지 않을 경우 불검출로 판정할 수 있다. 다만, 시가독소 유전자가 확인된 경우에는 반드시 순수 분리하여 분리된 균의 시가독소 유전자 보유 유무를 재확인한다. 시가독소가 확인된 집락에 대하여 생화학적 검사 등을 통하여 대장균으로 동정된 경우 장출혈성대장균으로 판정한다.

가. 증균배양

검체 25 g(25 mL)을 취하여 225 mL mTSB(배지 74)를 가한 후 35～37℃에서 24시간 증균배양한다. 검체를 가하지 아니한 동일 mTSB를 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다.

나. 분리배양

장출혈성대장균의 분리를 위해 TC-SMAC 배지(배지 66)와 BCIG 한천배지(배지 73)에 각각 접종하여 35～37℃에서 18～24시간 배양한다.

다. 확인시험

TC-SMAC배지에서는 sorbitol을 분해하지 않은 무색집락을, BCIG 한천배지에서는 청록색 집락 각 5개 이상을 취하여 보통한천배지(배지 8) 또는 Tryptic Soy 한천배지(배지 40)에 옮겨 35～37℃에서 18～24시간 배양한다. 전형적인 집락이 5개 이하일 경우 취할 수 있는 모든 집락에 대하여 확인시험을 실시한다. 배양 후 집락에 대하여 다음의 시가독소 유전자 확인시험을 수행한 후 시가독소 양성 집락을 대상으로 그람음성간균을 확인하고 생화학시험을 실시하여 대장균으로 확인된 경우 장출혈성대장균으로 판정한다.

라. 시가독소 유전자 확인시험

시가독소 유전자는 다음의 PCR법 또는 Real-time PCR법에 따라 실시한다.

1) PCR 법

(1) 주형유전자 준비

전형적인 집락을 취하여 멸균증류수 100 μL에 현탁한 후, 10분간 끓여 원심분리하고, 상등액 10∼20 μL를 취하여 시료로 사용한다.

※ 상기의 방법과 동등 이상인 유전자 추출키트 및 장비를 사용할 수 있다.

(2) PCR 프라이머 염기서열

유전자	염기서열(5‘→3’)	결과확인
stx1	(F) ATA AAT CGC CAT TCG TTG ACT AC (R) AGA ACG CCC ACT GAG ATC ATC	180 bp
stx2	(F) GGC ACT GTC TGA AAC TGC TCC (R) TCG CCA GTT ATC TGA CAT TCT G	255 bp

(3) PCR 반응액 조제

성분	최종농도	Stock용액 농도	1회 용량
완충액	1×	10×	5 μL
MgCl2	1.2 mM	12 mM	5 μL
dNTPs	0.2 mM	2.5 mM	4 μL
stx1 프라이머(F)	1 μM	50 pmol/μL	1 μL
stx1 프라이머(R)	1 μM	50 pmol/μL	1 μL
stx2 프라이머(F)	1 μM	50 pmol/μL	1 μL
stx2 프라이머(R)	1 μM	50 pmol/μL	1 μL
주형 DNA	25～50 ng 또는 10 μL	-	10 μL
Taq	2.5 U/tube	5 U/μL	0.5 μL
증류수	-	-	21.5 μL
총량	-	-	50 μL

(4) PCR 반응조건

PCR 반응은 아래 표의 반응 단계 1∼5까지 순차적으로 실시하되 5단계는 생략할 수 있다. 반응 1단계는 10회 반복으로 결합온도 65℃, 반응 2단계는 5회 반복으로 결합온도 64℃에서 시작하여 반응 회수마다 결합온도를 1℃ 감소시켜 마지막 5회는 결합온도가 60℃이며, 뒤의 반응 3단계는 10회 반복으로 결합온도 60℃로 유지하고, 반응 4단계는 신장 시간을 150초로 늘려 10회 반응시킨다.

반응 단계	구분	온도	시간	반응회수
1	변성(denaturation)	95℃	60초	10회
	결합(annealing)	65℃	120초
	신장(extension)	72℃	90초
2	변성(denaturation)	95℃	60초	5회
	결합(annealing)	64℃→60℃ 1℃/회 감소	120초
	신장(extension)	72℃	90초
3	변성(denaturation)	95℃	60초	10회
	결합(annealing)	60℃	120초
	신장(extension)	72℃	90초
4	변성(denaturation)	95℃	60초	10회
	결합(annealing)	60℃	120초
	신장(extension)	72℃	150초
5	보존(store)	4℃	-	-

※ 위 방법은 ISO의 Shiga toxin-producing Escherichia coli(STEC) PCR 검사법의 일부를 변경하여 사용한 것임

※ 상기 PCR 조건이 최적이 아닌 경우 변형하여 사용할 수 있다.

(5) 결과 확인

최종산물의 반응액 5 μL를 취하여 2.0% agarose gel로 100V에서 25분간 전기영동하고 에티디움 브로마이드(EtBr)(1 μL/mL) 또는 동등한 기능의 염색시약으로 염색한 후 UV를 이용하여 반응생성물을 확인한다. 이때, DNA 크기를 알 수 있도록 100 bp ladder를 동시에 전기영동 한다. stx1 유전자(180 bp) 또는/그리고 stx2 유전자(255 bp)의 반응생성물이 확인되는 경우 시가독소 유전자가 확인된 것으로 판정한다.

2) Real-time PCR법

(1) 주형 유전자 준비

상기 1) PCR법의 (1) 주형유전자 준비에 따른다.

(2) Real-time PCR 프라이머 염기서열

Target gene	염기서열(5‘→3’)		size (bp)
stx1	Forward	TTT GTY ACT GTS ACA GCW GAA GCY TTA CG	131
	Reverse	CCC CAG TTC ARW GTR AGR TCM ACR TC
	Probe	FAM-CTG GAT GAT CTC AGT GGG CGT TCT TAT GTA A-TAMRA
stx2	Forward	TTT GTY ACT GTS ACA GCW GAA GCY TTA CG	128
	Reverse	CCC CAG TTC ARW GTR AGR TCM ACR TC
	Probe	VIC-TCG TCA GGC ACT GTC TGA AAC TGC TCC-TAMRA

※ 상기 염기서열에서 Y는 (C, T), S는 (C, G), W는 (A, T), R은 (A, G), M은 (A, C)을 뜻한다. Probe의 FAM , VIC 또는 TAMRA 등은 장비에 맞게 선택할 수 있다.

(3) Real-time PCR 반응액 조제

성분	최종농도	Stock용액 농도	1회 용량
Master Mix	1×	2×	10 μL
stx1 프라이머 (F)	500 nM	10 pmol/μL	1 μL
stx1 프라이머 (R)	500 nM	10 pmol/μL	1 μL
stx1 프로브 (P)	400 nM	20 pmol/μL	0.4 μL
stx2 프라이머 (F)	500 nM	10 pmol/μL	1 μL
stx2 프라이머 (R)	500 nM	10 pmol/μL	1 μL
stx2 프로브 (P)	100 nM	5 pmol/μL	0.4 μL
주형 DNA	-	-	2 μL
증류수	-	-	3.2 μL
총량	-	-	20 μL

(4) Real-time PCR 반응조건

구분	온도	시간	반응회수
초기변성(initial denaturation)	95℃	10분	-
변성(denaturation)	95℃	10초	40
결합(annealing)	55℃	5초
신장(extension)	72℃	15초

※ 상기 Real-time PCR 반응액 조성 및 조건은 적절하게 변형하여 사용할 수 있다

(5) 결과 확인

증폭곡선이 확인된 경우 시가독소 유전자가 확인된 것으로 판정한다. 다만, 음성대조군에서 증폭곡선이 확인되거나 양성대조군에서 증폭곡선이 확인되지 않을 경우 재시험하여야 한다.

마. 장출혈성대장균 중 대장균 O157:H7의 확정이 필요할 경우 분리배양 시 TC-SMAC(배지 66) 배지를 사용하여 sorbitol을 분해하지 않는 무색집락에 대하여 최종적으로 시가독소 보유 및 대장균 동정 확인한다. 양성균주에 대하여 O157과 H7 혈청형의 결정은 제조사가 제시하는 방법에 따라 시험한다. 최종적으로 시가독소 유전자(stx1 또는/그리고 stx2) 양성, O157 및 H7 혈청 확인, 대장균으로 확인되었을 때 O157:H7으로 판정한다.

4.17 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)

가. 증균배양

검체 25 g 또는 25 mL를 취하여 PSBB 배지(배지 44) 225 mL을 가하고, 동시에 PSBB 배지를 가한 시험용액 10 mL를 취해 ITC 배지(배지 97) 90 mL에 가한다. 각각의 시험용액을 25℃에서 48시간 배양한다. 검체를 가하지 아니하고 동일한 방법으로 제조한 ITC 배지를 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다.

나. 분리배양

각각의 증균배양액 0.1 mL를 0.5% KOH가 함유된 0.5% 식염수 1 mL에 가하여 수초간 섞는다. 이 용액을 MacConkey 한천배지(배지 30)와 CIN 한천배지(배지 45)에 각각 접종하여 30℃에서 24±2시간 배양한다.

다. 확인시험

MacConkey 한천배지에서 유당을 비분해하는 집락이나 CIN 한천배지(배지 45)에서 중심부가 짙은 적색을 보이는 집락을 골라 각각 TSI 사면배지(배지 32)의 사면과 고층부에 접종하여, 35～37℃에서 18～24 시간 배양 후 고층부와 사면이 노랗고 가스와 황화수소가 발생하지 않은 균주를 선택하여 25℃, 37℃에서 운동성 시험 및 urea, citrate시험 등을 한다. 이 때 여시니아 엔테로콜리티카는 37℃에서는 운동성을 나타내지 않고 25℃에서 운동성을 가지는 특성이 있다. 또한 urea시험 양성, citrate시험 음성이며 그람음성 간균일 때 양성으로 판정한다.

4.18 바실루스 세레우스(Bacillus cereus)

4.18.1 정성시험

가. 분리배양

검체 25 g 또는 25 mL를 취하여 225 mL의 희석액을 가하여 균질화한 시험용액을 MYP한천배지(배지 46)에 접종하여 30℃, 24시간 배양하거나 PEMBA한천배지(배지 98)에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한다. 검체를 가하지 아니한 동일 희석액을 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다. 배양 후 MYP한천배지에서는 혼탁한 환을 갖는 분홍색 집락 또는 PEMBA한천배지에서는 혼탁한 환을 갖는 청녹색 집락을 선별한다. 이 때 명확하지 않을 경우 24시간 더 배양하여 관찰한다.

나. 확인시험

각 배지에서 전형적인 집락을 선별하여 보통한천배지(배지 8) 또는 Tryptic Soy 한천배지(배지 40)에 접종하고 30℃에서 24시간 배양한다. 배양 후 그람염색을 실시하여 포자를 갖는 그람양성 간균을 확인하고, 확인된 균은 nitrate 환원능, VP, β-hemolysis, tyrosine 분해능, 혐기배양시의 포도당 이용 등의 생화학시험을 실시하며, 추가로 30℃, 24시간 그리고 상온, 2∼3일 추가 배양하여 곤충독소단백질(Insecticidal crystal protein) 생성 확인시험주)도 실시한다.

주) 이 시험법은 Bacillus cereus와 Bacillus thuringiensis를 구분하는 시험법으로, 보통한천배지에 30℃, 24시간 그리고 상온, 2∼3일 추가 배양한 후 직접 또는 염색하여 현미경 관찰결과(×1000배), 곤충독소단백질이 확인되면 Bacillus thuringiensis로 한다.

4.18.2 정량시험

가. 균수 측정

검체 25 g 또는 25 mL를 취한 후, 225 mL의 희석액을 가하여 2분간 고속으로 균질화하여 시험용액으로 한다. 희석액을 사용하여 10배 단계 희석액을 만든다. MYP 한천평판배지(배지 46)에 단계별 희석용액 총 접종액이 1 mL이 되도록 3∼5장을 도말하여 30℃에서 24±2시간 배양한 후 집락 주변에 lecithinase를 생성하는 혼탁한 환이 있는 분홍색 집락을 계수한다. 검체를 가하지 아니한 동일 희석액을 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다.

나. 확인시험

계수한 평판에서 5개 이상의 전형적인 집락을 선별하여 보통한천배지(배지 8) 또는 Tryptic Soy 한천배지(배지 40)에 접종하고 30℃에서 18～24시간 배양한 후 4.18.1 정성시험 나. 확인시험에 따라 확인시험을 실시한다.

다. 균수계산

확인 동정된 균수에 희석배수를 곱하여 계산한다. 예로 10-1 희석용액을 0.2 mL씩 5장 도말 배양하여 5장의 집락을 합한 결과 100개의 전형적인 집락이 계수되었고 5개의 집락을 확인한 결과 3개의 집락이 바실루스 세레우스로 확인되었을 경우 100×(3/5)×10= 600으로 계산한다.

4.19 캠필로박터 제주니/콜리(Campylobacter jejuni/coli)

가. 증균배양

1) 식품 및 식육：검체 25 g(mL)를 Campylobacter supplement (A)(유가공품의 경우는 Campylobacter supplement(B))가 첨가된 HUNT(CEB) 배지(배지 47), Bolton 배지(배지 68) 또는 Preston 배지(배지 78) 100 mL에 넣고 균질화한 후 35∼37℃에서 4～5시간 동안 미호기적(5% O2, 10% CO2, 85% N2)으로 1차 증균하고 42±1℃에서  44 ± 4시간 미호기적으로 2차 증균한다. 다만, HUNT 배지를 사용할 경우, 2차 증균시 일반식품은 Cefoperazone 용액(0.8 g/100 mL) 0.4 mL를 첨가하고 유제품은 Rifampicin용액(0.125 g/100 mL) 0.4 mL를 첨가하여 배양한다. 모든 시험에서는 시험용액을 가하지 아니한 동일 증균배지를 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다.

2)  소, 돼지도체：제8. 일반시험법 5. 원유·식육·식용란의 시험법 5.2. 식육 시험법 5.2.3. 세균학적 시험법 가. 시료채취 및 방법 1) 도체 가)소 및 나)돼지의 시료채취 방법에 따라 멸균가아제나 스폰지로 시료를 채취한 후 멸균백에 넣고 25 mL BPW를 넣은 다음 균질화를 시킨 후 혈액을 첨가하지 않는 2XBolton 배지(2XBF-BEB) 25 mL를 넣고 미호기적 조건으로 42±1℃에서 48±2시간 배양한다. 시료를 채취하지 않은 동일 멸균가아제나 스폰지로 대조시험액을 제조하고 함께 시험하여 시험조작의 무균여부를 확인한다.

3) 닭, 오리도체：제8. 일반시험법 5. 원유·식육·식용란의 시험법 5.2. 식육 시험법 5.2.3. 세균학적 시험법 가. 시료채취 및 방법 1) 도체 다)닭의 시료채취방법에 따라 채취한 시료 30 mL에 혈액을 첨가하지 않는 2XBolton 배지(2XBF-BEB) 30 mL를 넣고 균질화 한 후 미호기적 조건에서 42±1℃ 48±2시간 배양한다. 시료 채취 시 사용한 동일 BPW 또는 BPD를 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다.

나. 분리배양

증균배양액을 modified Campy blood free 한천배지(배지 48) Abeyta-Hunt Blood 한천배지(배지 49), Preston 한천배지(배지 75), CCA 한천배지(배지 76) 또는 BCA 한천배지(배지 77)에 접종하여 42℃에서 24～48시간 미호기적으로 암소에서 배양한다.

다. 확인시험

Modified Campy blood free 한천배지상에서 원형 또는 불규칙한 형태로서 반투명한 흰색 또는 투명한 집락, Abeyta-Hunt Blood 한천배지(배지 49)상에서 무지개빛 광택 집락, CCA 및 BCA 한천배지에서는 불규칙한 가장자리를 가지고 점액이 있으며 회색인 평평한 집락(24～48시간 배양 후 용혈은 나타나지 않으며 분홍색이나 노란-회색집락이 나타나기도 한다), Preston 한천배지에서는 부드러운 모서리를 가진 불규칙한 원모양을 형성하는 반투명의 흰색집락(일부 균주는 황갈색 또는 약한 핑크색 집락을 형성)을 선별하여 혈액한천배지에 신속히 접종하여 42℃에서 24～48시간 미호기적으로 배양한다. 배양된 집락을 취하여, 암시야 또는 위상차현미경으로 검경하거나 또는 대비 염색하여 지그재그 모양을 관찰한다. 이때 대비염색은 10 mL 식염수에 2방울의 crystal violet을 혼합한 용액을 이용한다. 현미경상으로 확인된 균에 대하여 catalase 및 oxidase 양성임을 확인한다. 확인된 균에 대하여, 캠필로박터 제주니는 hippurate 분해 양성,  황화수소 비생성, 25℃에서 비생육 등을 확인하며, 캠필로박터 콜리는 hippurate 분해 음성, 25℃에서 비생육 여부 등 생화학시험을 실시한다.

4.20 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)

가. 증균배양

고형 또는 반고형물 검체는 동량의 젤라틴 인산완충액(시액 5)을 첨가하고 균질화하여 시험용액으로 하며, 액상 검체는 그대로 사용한다. 1～2 g 또는 1～2 mL의 검체를 2개의 Cooked Meat 배지(배지 33) 15 mL에 접종하여 35∼37℃에서 7일간 혐기배양하고 또 2개의 TPGY배지(배지 50)에 같은 방법으로 접종하여 26℃에서 7일간 혐기배양한다. 검체를 가하지 아니한 동일 젤라틴 인산완충액을 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다. (검체를 그대로 사용하는 액상 검체는 검체를 가하지 아니한 동일 Cook Meat 배지와 TPGY배지로 무균여부를 확인) 다만, 접종 전 각 배지는 10～15분간 중탕하여 탈산소한 후 신속히 냉각하여 사용하며, 검체는 배지 아래부분에 천천히 접종하고 교반하지 않는다. 배양 7일후 검경하여 전형적인 클로스트리디움이 관찰되면 다음의 분리배양을 실시하고, 관찰되지 않는 경우에는 추가적으로 10일간 더 배양한다.

나. 분리배양

증균배양액 1～2 mL와 동량의 여과 제균한 알코올을 잘 혼합하여 실온에서 1시간 방치한 후, Liver-Veal 난황한천배지(배지 51) 또는 혐기성 난황한천배지(배지 52)에 접종하여 35∼37℃에서 48±3시간 혐기적으로 배양한다. 배양 후 융기되거나 평평하며, 표면이 매끈하거나 거친 집락으로, 약간 퍼져 있거나 불규칙한 것을 선택하여 약 10개를 취한다. 경우에 따라서는 집락 주위에 혼탁한 환이 생긴다.

다. 확인시험

분리균에 대하여 Gram 양성의 간균과 균체 말단에 아포가 형성되는 것을 관찰하고, 호기조건으로 35∼37℃에서 2～3일간 배양하였을 경우 균이 발육되지 않는 것을 확인한다. 0.1%의 glucose를 첨가한 GAM 배지(배지 34)에 접종하여 35～37℃에서 1～4일간 배양하여 운동성이 있는 것을 양성으로 판정하며, 질산염환원능이 없으므로 glucose 0.1%, KNO3 0.3%를 가한 GAM 배지(배지 34)에 접종하여 35～37℃에서 2일간 배양한 후 Nitrite 지시약(시액 6)을 가하였을 경우 색의 변화가 없어야 한다. 우유를 pH 6.8되도록 조정하여, FeSO4 0.05～0.1 g을 첨가한 배지에 균을 접종하여 35∼37℃에서 배양한 후 우유를 분해하는 것을 양성으로 판정(각 독소 type에 따라 분해능이 다름)한다.

4.21 크로노박터(Cronobacter spp.)

가. 증균배양

검체 60 g 또는 60 mL를 무균적으로 채취하여 540 mL의 멸균증류수에 가한 후 35～37℃에서 18∼24시간 증균배양한다. 각각의 증균배양액 10 mL를 각각의 90 mL의 EE 배지(배지 59)에 첨가하여 35∼37℃에서 18∼24시간 2차 증균 배양한다. 검체를 가하지 아니한 동일 멸균증류수를 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다.

나. 분리배양

증균배양액을 CESA 한천배지(배지 60) 또는 E. sakazakii 한천배지(배지 62)에 도말하여 35∼37℃에서 24±2시간 배양하거나 CCI 한천배지(배지 99)에 도말하여 41.5±1℃에서 24±2시간 배양한다. 배양후 CESA 한천배지에서 청록색, E. sakazakii 한천배지에서는 장파장의 자외선(366nm) 조사하에 형광을 나타내는 전형적인 집락, CCI 한천배지(배지 99)에서 청록색 집락 등 전형적인 집락들에 대하여 확인시험을 실시한다.

다. 확인시험

5개의 전형적인 집락을 취하여 Tryptic soy 한천배지(배지 40)에 옮겨 25℃에서 48～ 72시간 배양한 후, 황색 집락을 선별하여 생화학적 시험을 실시한다. 해당 집락에 대한 생화학적 시험결과 Oxidase(-), L-Lysine decarboxylase(-), L-Ornithine decarboxylase(+), L-Arginine dihydrolase(+), sucrose(+), dulcitol(-), adonitol(-), raffinose(+), D-sorbitol(-), x-methyl-D-glucoside(+), D-arabitol(-)일 경우 Cronobacter spp. 양성으로 판정한다.

4.22 탄저균(Bacillus anthracis)

가. 배양 및 균분리

검체 25 g 또는 25 mL에 희석액 50 mL을 가하여 분쇄 혼합한 뒤, 62.5±0.5℃ 항온수조에서 30～60분간 가열처리한다. 배양된 유제를 10배 단계 희석하여 각 희석액으로부터 100 μL를 취하여 혈액한천배지(배지 79)에 도말하여 37℃에서 24시간 배양한다. 검체를 가하지 아니한 동일 희석액을 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다. 탄저균은 그 균의 특이한 회백색의 축모상 혹은 곰보유리모양의 집락을 형성하며 혈액한천배지에서는 용혈성이 거의 없고 액체배지에서는 침전하여 발육하며 상층부는 투명하고 균막을 형성하지 않는다. 의심되는 집락을 도말하여 염색하면 그람양성의 대간균으로서 양단이 직각으로 갈라져 있고 낚시대 모양의 연쇄상을 나타낸다.

나. 동물시험

다른 방법으로도 탄저균을 분리해내지 못 하는 경우, 동물접종시험을 고려할 수 있다. 62.5℃에서 15분간 가열한 후 다 자란 마우스의 피하에 0.05～0.1 mL 접종한다. Guinea pig의 양쪽 하퇴부 근육에 0.2 mL씩 총 0.4 mL 접종한다. 양성인 경우 48～72시간 내에 폐사한다. 이를 해부하여 병리학적 소견을 관찰하고 도말하여 협막염색을 실시하여 협막형성균을 검경으로 확인한 후 다시 균을 분리 동정한다. 폐사된 동물의 혈액으로부터 균을 분리배양 할 수 있다.

다. PCR 반응을 통한 병원성 시험

보통한천배지(배지 8)에서 배양한 탄저균 1 백금이를  25 μL의 증류수에 희석하여 95℃에서 20분간 가열한 다음, 4℃로 식혀 원심분리하여 상층액을 PCR반응의 template로 사용한다. pX01과 pX02 plasmid의 존재를 확인할 수 있는 primer는 아래와 같다.

Target	프라이머	Sequence 5'-3'	크기	농도
Protective antigen(PA)	PA 5 3048-3029	TCC-TAA-CAC-TAA-CGA-AGT-CG	596 bp	1 mM
	PA 8 2452-2471	GAG-GTA-GAA-GGA-TAT-ACG-GT
Capsule	1234 1411-1430	CTG-AGC-CAT-TAA-TCG-ATA-TG	846 bp	0.2 mM
	1301 2257-2238	TCC-CAC-TTA-CGT-AAT-CTG-AG

PCR은 총 50 μL로 실행하되, dATP, dCTP, dTTP, dGTP 각각 200 μM씩, MgCl2 1.5 mM, Taq DNA polymerase 2.5 unit, NH4 buffer를 넣고 template DNA를 5 μL 첨가한다. 전기영동은 2% agarose gel에서 가장 잘 확인할 수 있다. PCR 반응조건은 아래와 같다.

구분	온도	시간	반응회수
초기변성	95℃	5분	-
변성	95℃	0.5분	30 회
결합	55℃	0.5분
신장	72℃	0.5분
최종신장	72℃	5분	-

※ 상기 PCR 조건이 최적이 아닌 경우 변형하여 사용할 수 있다.

4.23 결핵균

가. 배양 전 확인법 및 균 배양 후 균 분리검사

우유와 같은 액상의 검체는 그대로 사용하고, 식육 및 식육가공품은 검체 25 g에 희석액 225 mL을 가한 후 유제액을 제조하여 사용한다. 액상 검체 또는 유제액 25 mL를 3,000 rpm에서 30분간 원심분리 하여 상층부를 새로운 시험관에 취하고 침전물에서 1 백금이를 취하여 도말표본을 만들고 Ziel-Neelsen법으로 항산성염색을 실시하여 항산성균을 검경으로 확인한다. 상층부에는 동량의 8% NaOH액을, 침전물에는 그의 약 10배량의 4% NaOH액을 가하여 잘 혼합한 후 각각 0.1 mL씩을 Lowenstein-Jensen 사면배지(배지 80) 또는 Middlebrook 7H10 한천배지(배지 81)에  접종한 후 37℃에서 8주간 배양한다. 유제액을 제조하여 사용하는 경우에는 검체를 가하지 아니한 동일 희석액을 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다. 배양기간 동안 배양유무를 육안으로 관찰한다. 배양이 육안으로 관찰되면 slide glass에 균를 도말하여 Ziehl-Neelsen법으로 항산성염색을 실시하여 항산성균을 검경으로 확인한다. 결핵균의 성장은 일반적으로 3∼6주 배양동안 관찰된다. 특이적으로 느린 성장패턴과 균 모양으로 결핵균을 잠정적으로 진단할 수 있다.

나. 확인검사

1) 생화학적 검사

모든 분리균주는 결핵균 동정을 위해 생화학적 검사(나이아신 생산과 나이트레이트 환원) 또는 특이유전자 동정에 의한 확인이 필요하다. 적절한 피루베이트 고형배지(배지 86, pyruvate-based solid medium)에서 결핵균의 균은 담황색이다. 결핵균은 37℃에서 느리게 성장하며, 22℃ 또는 45℃에서는 성장하지 않는다.

2) PCR 시험 방법

표 1의 primer set와 표 2의 PCR 조건에 따라 PCR을 실시한다. 공통적으로 DNA 농도는 10 ng이상, primer forward 및 reverse는 각각 20 pmol 씩 넣고, 상업적 시약인 20 μL용 또는 50 μL용 PCR premix를 이용하여 PCR을 수행한다.

표 1. 결핵균 PCR용 primer set

Target	Primer sequence		Size
IS6110	Forward	5‘-GGA-CAA-CGC-CGA-ATT-GCG-3'	559 bp
	Reverse	5'-TAG-GCG-TCG-GTG-ACA-AAG-GCC-AC-3'
IS1081	Forward	5'-CTG-CTC-TCG-ACG-TTC-ATC-GCC-G-3'	135 bp
	Reverse	5'-GGC-ACG-GGT-GTC-GAA-ATC-ACG-3'
MPB70	Forward	5'-AAA-GAA-TTC-GGA-CGG-CTC-CGA-AGA-AAT-C-3'	678 bp
	Reverse	5'-CCC-GGA-TCC-TTA-CGC-CGG-AGG-CAT-TAG-CAC-3'
16S- rRNA	Forward	5‘-GTT-CGA-ACG-GGT-GAG-TAA-CAC-GTG-3'	984 bp
	Reverse	5'-TGT-TAA-CAT-CTC-ACG-ACA-CGA-GCT-3'

표 2. PCR 반응 조건

	IS6110		IS1081		MPB70		16s-rRNA
초기변성	95℃, 5분		95℃, 8분		95℃, 5분		94℃, 5분
변성	95℃, 45초	35회	95℃, 10초	45회	95℃, 1분	30회	94℃, 30초	40회
결합	60℃, 45초		58℃, 30초		55℃, 2분		58℃, 30초
신장	72℃, 45초		72℃, 20초		72℃, 1분		72℃, 40초
최종신장	72℃, 10분		72℃, 2분		72℃, 5분		72℃, 5분

※ 상기 PCR 조건이 최적이 아닌 경우 변형하여 사용할 수 있다.

다. 동물실험

배양하고 남은 시료는 bromthymol blue(0.2%)를 가한 염산수용액을 적하하여 중화시킨 후1～2 mL씩을 guinea pig의 피내에 접종한다. Guinea pig은 tuberculin 피내반응 음성인 것으로서 체중 300 g 이상인 것을 사용하며 접종 후 2주간부터 가끔 tuberculin 반응과 체중을 조사한다. 결핵균에 감염을 받은 경우에는 보통 2～5주간부터 피내반응 양성으로 나타나고 체중은 점차로 감소하며 접종한 국소에 경결 또는 궤양이 생기며 국소 임파절이 종창한다. 4～8주 후에 guinea pig은 죽고 부검하여 임파절 및 각 장기의 결핵성 변화를 관찰한다. 병변부위의 장기를 무균적으로 채취하여 1% NaOH로 유제를 만들고 그 0.1 mL씩을 Lowenstein-Jensen 사면배지(배지 80) 또는 Middlebrook 7H10 한천배지(배지 81)에 배양하여 다시 결핵균을 확인한다. 결핵균의 항산성염색 방법은 다음과 같다.

(가) 도말표본을 가열하여 고정한다.

(나) Ziehl's carbol fuchsin으로 가열하면서 3분간 염색하고 증류수로 수세한다.

(다) Acid alcohol로 2분간 탈색한 다음 수세한다.

(라) Alkaline brilliant green으로 3분간 염색한 다음 세척한다.

(마) 현미경으로 항산성균을 관찰한다.

4.24 브루셀라(Brucella spp.)

가. 배양 및 균 분리

검체 25 g 또는 25 mL을 amphotericin B 1 ㎍/mL, vancomycin 20 ㎍/mL가 첨가된 serum dextrose 배지(배지 82), TSB 배지(배지 23) 또는 Brucella 배지(배지 85)  225 mL에 넣은 후 균질화 한 다음 5～10%의 CO2 가스 주입이 되는 37℃ 배양기에서 6주 동안 배양하면서 주마다 배지에 도말하여 확인한다. 검체를 가하지 아니한 증균배지를 대조시험액으로 하여 시험조작의 무균여부를 확인한다. 다만, 검체가 심하게 오염되었거나 브루셀라균이 매우 낮은 농도로 오염되었을 가능성이 클 경우에 동물실험을 할 수 있다.

나. 동물실험

우유의 경우는 25 mL를 3,000 rpm으로 30분간 원심분리 하여 유지부와 침전물을 직접도말 배양하고 두 마리 이상의 guinea pig(250～300 g 체중)에 3～5 mL씩을 피하 또는 찰과상을 입은 피부에, 세 마리 이상의 마우스(12～15 g)의 정맥 또는 복강 내에 0.25～0.5 mL씩을 주사한다.

고체시료는 시료 25 g에 희석액 225 mL를 가한 후 유제액을 조제하여 직접도말 배양하고 또한 유제액을 멸균가아제로 여과한 후 그 여액 또는 1,000 rpm에서 5분간 원심분리 하여 얻은 상층액을 실험동물에 접종한다. 실험동물 접종 3주 후에 채취한 혈청에 대해 브루셀라 항체가 형성되었는지 여부를 검사하고 비장에서 브루셀라균을 분리배양 한다.

다. 확인검사

1) 생화학적 검사

브루셀라균의 분리용 배지는 Serum Dextrose 한천배지(배지 83)(또는 Liver 한천배지, 배지 26), Brucella 한천배지(배지 84)를 사용하며 5～10% 탄산가스 조건하에 37℃에서 3～5일간 배양한다. 이때 형성된 집락은 소원형으로서 다소 융기되어 있고 투명한 빛깔이 있으며 착색되어 있지 않으나 시일이 경과된 집락은 약간 불투명하고 갈색을 띤 회백색을 보인다. 염색하여 검경하면 그람음성의 단간균으로 구균처럼 보인다. 액체배지에서 37℃로 24시간 배양하면 균일 혼탁하게 발육하고 10일 이상 경과하면 더욱 혼탁하여지면서 적조한 균덩어리(clamp)가 균막과 같이 표면으로부터 관벽에 엉긴다. 이 균은 운동성이 없으며 당류도 거의 분해하지 않고 혈액배지에서 용혈성이 없다. MacConkey 한천배지(배지 30)에서 성장하지 않으며, urease 양성, oxidase 양성, catalase 양성 등 생화학적 시험 결과로 최종 판정한다.

2) PCR 시험방법

표 1의 primer set와 표2의 PCR 조건에 따라 PCR을 실시한다. Multiplex PCR의 경우 DNA 농도는 25 ng이상이며, 브루셀라 아보투스(B. abortus)와 종 확인 시 사용되는 BASS-PCR의 DNA농도는 1 ng이상이어야 한다. 두 PCR 기법에 사용되는 primer forward 및 reverse는 각각 10 pmol 씩 넣고, 상업적 시약인 20 μL용 PCR premix를 이용하여 PCR을 수행한다.

표1. 브루셀라균 PCR용 primer set

Target	Primer sequence			Size (bp)
Multiplex-PCR
BME1 0998f-0997r	Forward		5‘-ATC-CTA-TTG-CCC-CGA-TAA-GG-3'	1,682
	Reverse		5'-GCT-TCG-CAT-TTT-CAC-TGT-AGC-3'
BME2 0843f-0844r	Forward		5'-TTT-ACA-CAG-GCA-ATC-CAG-CA-3'	1,071
	Reverse		5'-GCG-TCC-AGT-TGT-TGT-TGA-TG-3'
BME2 0722f-0721r	Forward		5‘-CCA-ACC-GTA-TGT-CCT-CTC-3'	766
	Reverse		5'-TGC-GGG-AAC-TGG-TGT-TCG-AC-3'
BME2 0428f-0428r	Forward		5'-GCC-GCT-ATT-ATG-TGG-ACT-GG-3'	587
	Reverse		5'-AAT-GAC-TTC-ACG-GTC-GTT-CG-3'
BME1 0535f-0536r	Forward		5‘-GCG-CAT-TCT-TCG-GTT-ATG-AA-3'	450
	Reverse		5'-CGC-AGG-CGA-AAA-CAG-CTA-TAA-3'
BME1 r02f-r02r	Forward		5'-CTA-CTC-AAG-GAC-AAC-AGG-T-3'	344
	Reverse		5'-TGT-GTC-GTT-TAA-GGC-AAT-AG-3'
BR 0953f-0953r	Forward		5'-GGA-ACA-CTA-CGC-CAC-CTT-GT-3'	272
	Reverse		5'-GAT-GGA-GCA-AAC-GCT-GAA-G-3'
BME1 0752f-0752r	Forward		5'-CAG-GCA-AAC-CCT-CAG-AAG-C-3'	218
	Reverse		5'-GAT-GTG-GTA-ACG-CAC-ACC-AA-3'
BME2 0987f-0987r	Forward		5'-CGC-AGA-CAG-TGA-CCA-TCA-AA-3'	152
	Reverse		5'-GTA-TTC-AGC-CCC-CGT-TAC-CT-3'
BASS-PCR
IS711-specific		TGC-CGA-TCA-CTT-AAG-GGC-CTT-CAT-TGC-CAG
Abortus-specific		GAC-GAA-CGG-AAT-TTT-TCC-AAT-CCC
16S-universal-F		GTG-CCA-GCA-GCC-GCC-GTA-ATA-C
16S-universal-R		TGG-TGT-GAC-GGG-CGG-TGT-GTA-CAA-G
eri-F		GCG-CCG-CGA-AGA-ACT-TAT-CAA
eri-R		CGC-CAT-GTT-AGC-GGC-GGT-GA
RB51-3		GCC-AAC-CAA-CCC-AAA-TGC-TCA-CAA

	B. abortus	B. abortus S19	B. abortus RB51	Brucella spp.	Bacteria
Locus	Size (bp)
16S	800	800	800	800	800
IS711/alkB	500	500	500	-	-
IS711/wbo	-	-	300	-	-
eri	180		180	180	-

표2. PCR 반응 조건

	Multiplex PCR		BASS-PCR
초기변성	95℃, 7분		95℃, 5분
변성	95℃, 35초	30회	95℃, 30초	40회
결합	61℃, 2분		61℃, 30초
신장	72℃, 1분		72℃, 1분
최종신장	72℃, 6분		72℃, 5분

※ 상기 PCR 조건이 최적이 아닌 경우 변형하여 사용할 수 있다.

4.25 식품용수 등의 노로바이러스

가. 시약 및 시액

1) 2% 티오황산나트륨(Sodium thiosulfate: Na2S2O3) 용액

4,800 mL의 증류수에 티오황산나트륨 100 g을 녹여 최종 5,000 mL의 용액을 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다.

2) 1M 염산(HCl) 용액

1M 염산(HCl) 용액은 식품용수 채수 시 검체의 pH를 조정하는데 사용한다.

3) 1.5% Beef extract(desiccated powder) 용액

1,900 mL의 증류수에 Beef extract 분말 30 g과 glycine 7.5 g(최종농도 = 0.05 M)을 넣고 1M  NaOH를 이용하여 pH 9.5로 조정한 후 최종 2 L로 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다. Beef extract 용액은 4℃에서 일주일간 혹은 -20℃에서 장기간동안 보관할 수 있다.

4) 0.15 M 인산일수소나트륨, 7수화물(Sodium phosphate, dibasic, (Na2HPO4  7H2O)) 용액

950 mL의 증류수에 Sodium phosphate  40.2 g을 넣고 1M  NaOH를 이용하여 pH 9.5로 조정한 후 최종 1 L로 제조하고 121℃, 15분간 고압증기 멸균한다.

5) 1M 수산화나트륨(NaOH) 용액

400 mL의 증류수에 20 g의 수산화나트륨을 넣고 최종 500 mL로 제조하여 수산화나트륨 용액을 준비한다. 수산화나트륨 용액은 상온에서 수개월 동안 보관할 수 있다.

6) 노로바이러스 유전자 추출 키트(Viral RNA Mini Kits)

시판되는 바이러스 RNA 추출 키트(kit)를 사용한다.

※ 재현성 및 검출효율 등을 고려하여 QIAGEN-Viral RNA Mini Kits 또는 동등 이상의 제품사용 가능

나. 장치 및 기구

1) 검체 채수과정

가) 표준필터장치：식품용수 1,500∼1,800 L을 채수하는 장치

구성：용수 유입구, 단일주입기, 유량조절밸브, 압력게이지, 탈리액 주입구, 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter), 카트리지 하우징(cartridge housing), 탈리액 유출구, 유량계, 용수 유출구

※ 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter)：1-MDS, NanoCeram 또는 이와 동등한 것

나) 휴대용 pH 측정기：식품용수의 수소이온농도를 측정한다.

다) 휴대용 탁도 측정기：식품용수의 혼탁도를 측정한다.

라) 휴대용 염소 농도 측정기：식품용수의 잔류염소농도를 측정한다.

마) 휴대용 아이스박스：식품용수 채수 후 양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter)를 운반하기 위해 사용한다.

바) 상업용 얼음팩：양전하 카트리지 필터(positive cartridge filter) 운반 시 냉장상태 유지용으로 사용한다.

사) 기타：공구상자, 2 L 멸균 비커, 멸균된 알루미늄박, 클램프, 바이러스시료 검체기록부, 멸균장갑, 수은온도계, 멸균 메스실린더, 채수용 호스

ⓐ 용수 유입구 ⓑ단일주입기 ⓒ유량조절밸브 ⓓ압력게이지 ⓔ탈리액 주입구 ⓕ감압단추

ⓖ양전하 카트리지 필터 ⓗ카트리지 하우징 ⓘ탈리액 유출구 ⓙ유량계 ⓚ용수 유출구

《표준필터장치》

2) 바이러스 탈리과정

가) 연동정량펌프：1.5% 양전하 카트리지 필터로 유입시켜 흡착된 바이러스를 탈리하기 위한 장치

나) 연동정량펌프 탈리액 유입용 호스, 탈리액 유출용 호스

다) 자석교반기 및 자석교반 막대

라) 하우징 거치대, 탈리액 유입구, 탈리액 유출구, 압력게이지

3) 바이러스 농축과정

가) 원심분리기(4 ℃, 2,500～10,000 G)

나) 원심분리용기(50～500 mL 용량)

다) 0.22 μm 주사기 필터(30 mL 용량)

다. 시험방법

1) 식품용수 채수

채수할 때는 멸균된 장갑을 착용하여 노로바이러스가 오염되지 않게 주의하고 오염이 될 수 있는 환경요인들을 피하여야 한다. 멸균된 장갑이 사람의 피부나 오염 가능성이 있는 장치, 부품에 접촉이 되었을 경우 장갑을 바꿔 착용한다(예：수도꼭지나 다른 환경요소 표면).

가) 채수하려는 검체의 배출구(수도꼭지 등)를 2～3분 정도 열고 식품용수를 흘려보낸다. 배출구에 채수호스를 장착 시 누수가 되지 않도록 클램프를 이용하여 단단히 연결하고 탁도가 균일할 때까지 흘려보낸 후 배출구를 잠근다.

나) 염소(Chlorine, HOCl)나 불꽃버너를 이용하여 배출구(수도꼭지 등)를 가열 또는 살균한다.

다) 채수용 호스의 알루미늄박을 제거한 후 채수 할 배출구에 연결하고 표준필터장치 용수 유입구(ⓐ)에 호스를 연결한다. 이 단계에서 양전하 카트리지 필터(ⓖ)는 연결하지 않는다.

라) 천천히 배출구를 열어 압력게이지가 30 PSI가 넘지 않도록 배출구를 조절하고 76 L (20 gal)의 식품용수를 흘려보낸다.

마) 식품용수 76 L를 흘려 보낸 후 일부를 2 L 멸균 비커에 받아 용수의 탁도, pH, 온도, 염소농도를 각 각 측정하여 검체번호, 채수위치, 채수자의 이름과 함께 바이러스 검체채수기록부에 기록한다. pH 측정기는 사용 전 보정(calibration) 한다.

바) 용수 배출구(수도꼭지 등)를 잠그고 검체가 다음의 조건에 해당되어 부가장치의 연결이 필요한지의 여부를 결정하여 연결한다.

(1) pH 8이상일 경우 멸균된 튜브로 단일주입기(ⓑ)와 1 M 염산 용액이 담긴 메스실린더를 연결하고, 배출구(수도꼭지 등)를 다시 열어 용수의 pH가 6.5～7.5가 되도록 단일 주입기를 통해 1 M 염산 용액을 흘려보낸다. 용수유출구(ⓚ)로 흘러나온 용수의 pH를 측정해 바이러스 검체 채수기록부에 기록한다.

(2) 잔류염소 제거를 위해 위와 같이 단일주입기를 연결하여 식품용수 3.8 L(1 gal) 당 2% 티오황산나트륨 용액 10 mL이 주입되도록 한다.

* (1)와 (2)번이 모두 해당할 경우 이중주입기를 연결하여 사용한다.

사) 바이러스검체 채수기록부에 검체 채취일, 시작 시간, 유량계의 초기 수치를 기록한다.

아) 알루미늄박을 제거한양전하 카트리지 필터를 탈리액 주입구(ⓔ)와 유출구(ⓘ) 사이에 연결한다.

자) 용수를 천천히 흐르게 하면서 카트리지 하우징 상단의 감압단추(ⓕ,vent button)를 눌러 내부공기가 완전히 빠지도록 한 후, 수도꼭지를 완전히 열어 준다.

차) 압력게이지가 30 PSI 이하로 유지되도록 유량조절 밸브를 조정하고 식품용수 1,500～1,800 L를 통과시킨 후, 용수 배출구(수도꼭지 등)를 잠근다.

카) 바이러스 검체 채수기록부에 검체채취 종료일, 종료 시간, 유량계의 최종 수치 등을 기록한다.

타) 표준필터장치로부터 카트리지 하우징(ⓗ)을 분리하고 양전하 카트리지 필터를 거꾸로 하여 남은 물을 버린 후 하우징 양끝의 연결된 개구부를 멸균된 알루미늄박으로 싼다.

파) 양전하 카트리지 필터를 아이스박스에 담고 얼음팩 등을 사용하여 냉장상태(냉동시켜서는 아니 된다)로 유지하여 즉시 실험실로 운반한다.

2) 노로바이러스 탈리과정

가) 냉장 보관하여 운반한 필터는 채수 시작 시간부터 24시간 내에 실험실에서 바이러스 탈리 시험을 실시하여야 한다. 다만, 부득이한 경우로 인해 24시간 내에 탈리시험이 불가할 경우 최대 72시간이 넘지 않도록 한다.

나) 탈리용 거치대에 카트리지 하우징을 장착한 후 유량조절 밸브를 모두 닫는다.

다) 탈리액 주입구에 연동정량펌프 호스를 연결한 후 연동정량펌프와 1.5% Beef extract 용액이 채워져 있는 유리병에 호스를 차례로 연결하되, 1-MDS 필터는 1 L, NanoCeram 필터에는 0.5 L의 1.5% Beef extract 용액을 사용한다.

라) 탈리액 유출구에 유출용 호스를 연결하여 1.5% Beef extract 용액이 들어 있는 유리병에 넣고 탈리액 유출구를 닫는다.

마) 연동정량펌프를 가동하여양전하 카트리지 필터 하우징 안으로 1.5% Beef extract 용액이 양전하 카트리지 필터 내에 완전히 차도록 한 후 감압단추를 통해 1.5% Beef extract 용액이 넘쳐 흘러나오기 시작하면 감압단추에서 손을 떼고, 연동정량펌프 가동을 멈춘 후 5분간 정치한다.

※ 감압단추는 탈리액이 양전하 카트리지 필터 안으로 가득 채워질 때까지 눌러준다.

바) 탈리액 유출구를 열고 연동정량펌프를 다시 가동한 후 하우징에 채워져 있는 1.5% Beef extract 용액이 서서히 필터를 통과하도록 한다. 통과한 완충액은 1.5% Beef extract 용액이 들어있던 유리병에 수집한다. 탈리액을 회수할 때는 거품이 없도록 주의하여야 한다.

※ 연동정량펌프 대신 양압펌프와 압력통을 사용하여 탈리과정을 진행할 수도 있다.

사) 유리병에 수집된 탈리액은 라)～바)의 과정을 2회 반복한다.

아) 최종 탈리액은 1 M 염산 용액으로 pH를 7.0～7.5 사이로 조절하고 멸균된 메스실린더를 사용하여 부피를 기록한다.

자) 탈리액은 24시간 이내에 농축시험이 가능할 경우 4℃에서 보관하며, 농축 시험을 즉시 시행하기 어려울 때에는 -70℃에서 보관한다.

3) 노로바이러스 농축과정

가) 최종 탈리액을 교반기에서 혼합하면서 1 M 염산용액으로 pH를 3.5±0.1로 조절한 후, 실온에서 30분간 천천히 섞는다.

나) 침전물이 생기면 탈리액을 멸균한 원심분리용기에 옮겨 원심분리한다(2,500 G 15분, 4℃).

다) 원심분리 후, 상등액을 제거하고 남은 침전물에 0.15 M sodium phosphate 완충액(pH 9.0～9.5)을  20～30 mL 넣어 완전히 부유 시킨 후 실온에 10분간 방치한다.

라) 부유시킨 용액을 원심분리한다(7,000 G, 10분, 4℃).

마) 상등액을 취해 1 M 염산용액으로 pH 7.0～7.5로 조절한다.

바) 미생물오염을 방지하기 위해 30 mL 주사기를 이용하여 상등액을 0.22 μm 주사기 필터로 여과한다. 검체 중의 바이러스가 필터에 흡착되는 것을 방지하기 위하여 사전에 0.22 μm 주사기 필터에 10～20 mL의 1.5% Beef extract 용액(pH 7.0～7.5)을 통과시킨다.

사) 최종 농축 검체량(FCSV=final concentrated sample volume)을 기록하고 검체를 24시간 이내에 분석할 경우는 4℃에 보관하고 나머지는 분석 전까지 -70℃에 보관한다.

아) 최종 농축검체 20～30 mL는 노로바이러스 유전자 추출을 위한 검체로 사용한다.

4) 노로바이러스 유전자 추출 과정

시판되는 바이러스 RNA 추출 키트(kit)를 사용하며, 제조사가 제시하는 적절한 실험법에 따라 실시한다.

※ 재현성 및 검출효율 등을 고려하여 QIAGEN-Viral RNA Mini Kits 또는 동등 이상의 제품이 사용이 가능하며, 또한 자동유전자 추출장치를 사용할 경우에도 바이러스 RNA 추출 키트를 사용하여 노로바이러스 유전자를 추출할 수 있다.

가) 바이러스 유전자 추출 시 검체와 동일한 과정으로 음성대조군(negative control)을 사용하여 유전자를 추출하며 검체의 경우 시험 진행 중 오염 여부를 확인하기 위해 2개의 RNA를 추출한다.

나) 검체 농축액과 음성대조군 각 280 μL에 AVL 완충액(guanidine thiocyanate 함유) 1,120 μL를 각각 혼합하여 실온에서 10분 동안 방치한 후 가볍게 원심분리기를 이용하여 원심분리(spin-down)한다.

다) 여기에 95～100% 에탄올 1,120 μL을 넣어 혼합한 후 가볍게 원심분리(spin-down)한다.

라) 혼합액 630 μL을 소량 원심(Mini spin) 컬럼으로 옮겨 6,000 G에서 1분간 원심분리하고 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮긴 다음 남은 혼합액을 630 μL씩 동일한 방법으로 컬럼에 첨가하여 원심분리한다.

마) 소량 원심(Mini spin) 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮겨 AW1 완충액(guanidine hydrochloride 함유) 500 μL을 넣고 6,000 G로 1분간 원심분리 후 컬럼을 새로운 회수용(collection) 튜브로 옮긴다.

바) AW2 완충액 500 μL을 넣고 20,000 G로 3분간 원심분리한 후 컬럼을 새로운 1.5 mL 회수용(collection) 튜브로 옮긴다.

사) AVE 완충액(sodium azide 함유) 60 μL를 넣고 6,000 G로 1분간 원심분리하여 다음의 RT-PCR을 수행하기 위한 주형(template)으로 사용한다.

5) 노로바이러스 유전자 PCR 과정 및 결과판정

PCR로 노로바이러스의 유전자형(GI과 GII)을 각각 확인하기 위하여 유전자형에 따라 프라이머를 바꿔 Semi-nested PCR을 한다. RT-PCR(Reverse transcription-Polymerase chain reaction)과정에서는 노로바이러스 유전자와 로타바이러스 유전자를 조합하여 합성한 RNA(GI, GII)를 PCR 양성대조군으로 사용한다.

가) One-step RT-PCR 방법은 아래와 같이 수행한다.

(1) PCR 조성조건은 RT-PCR pre-mix 10 μL(Reverse transcriptase 0.5 μL 포함), 프라이머는 GI과 GII 형(type)별로 달리하여 GI 형(type)(GI-F1M, GI-R1M), GII 형(type)(GII-F1M, GII-R1M) 각 2 μL, 추출 RNA 5 μL를 첨가하여 증류수로 총 25 μL로 맞추고 양성대조군의 경우 검체의 RT-PCR 혼합 조성과 동일하게 한 후 GI과 GII 양성대조군 RNA 5 μL를 각각 넣어 총 25 μL로 반응시킨다.

(2) PCR 반응조건은 GI과 GII 모두 45℃에서 30분, 94℃에서 5분 DNA를 변성시키고, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분 30초를 1회로 하여 35회 반응시킨 후, 72℃에서 7분간 연장 반응시킨다. 상기 반응 종료 후 PCR 생성물에 대하여 Semi-nested PCR을 실시한다.

표 1. 노로바이러스 One-step RT-PCR 반응액 조성

Component	Volume	Genogroup
		GI primers	GII primers
Mastermix(2X)	9.5 μL	-	-
Reverse transcriptase(50unit/μL)	0.5 μL	-	-
D.W.	6 μL	-	-
Forward primer(20pmol)	2 μL	GI-FIM	GII-FIM
Reverse primer(20pmol)	2 μL	GI-RIM	GII-RIM
Extracted RNA, PCR control	5 μL	-	-
Total	25 μL

표 2. One-step RT-PCR 반응조건 및 온도

	온도	시간	Cycle
cDNA 합성 (cDNA synthesis) 초기 변성(predenaturation)	45℃ 94℃	30 min 5 min	1 cycle
변성(denaturation) 결합(annealing) 확장(extension)	94℃ 55℃ 72℃	30 sec 30 sec 1 min 30 sec	35 cycle
최종신장(post-elongation)	72℃	7 min	1 cycle
보관	4℃	∞	∞

나) Semi-nested PCR 방법은 아래와 같이 수행한다.

(1) One-step RT-PCR 산물을 주형으로 하여 Semi-nested PCR을 실시한다. 1차 PCR산물 2 μL, 10x 완충액(MgCl2 포함) 5 μL, dNTPs(10 mM) 4 μL, Taq DNA polymerase (5 unit/μL) 1 μL, 프라이머는 GI과 GII 형(type)별로 달리하여 GI 형(type)(GI-F2-U, GI-R1M), GII 형(type)(GII-F3M, GII-R1M-U) 각 2.5 μL 첨가한 다음 최종 증류수로 총 50 μL로 맞춘 후 Semi-nested PCR을 실시한다.

(2) PCR 반응조건은 GI과 GII 모두 94℃에서 5분간 DNA를 변성시키고 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분 30초를 1회로 하여 25회를 반응시킨 후 72℃에서 7분간 연장 반응한다.

표 3. 노로바이러스 Semi-nested PCR 반응액 조성

Component	Volume	Genogroup
		GI primers	GII primers
dNTPs(10mM)	4 μL	-	-
10x Buffer(with MgCl2)	5 μL	-	-
D.W.	33 μL	-	-
Forward primer(20 pmol)	2.5 μL	GI-F2-U	GII-F3M
Reverse primer(20 pmol)	2.5 μL	GI-RIM	GII-R1M-U
Taq DNA polymerase(5 unit/μL)	1 μL	-	-
1st PCR Product	2 μL	-	-
Total	50 μL

표 4. Semi-nested PCR 반응조건 및 온도

	온도	시간	cycle
초기 변성 (predenaturation)	94℃	5 min	1 cycle
변성(denaturation) 결합(annealing) 확장(extension)	94℃ 55℃ 72℃	30 sec 30 sec 1 min 30 sec	25 cycle
최종신장(post-elongation)	72℃	7 min	1 cycle
보관	4℃	∞	∞

(3) PCR 반응 종료 후 PCR 증폭 반응액 5 μL를 전기영동 완충액(gel loading buffer) 1 μL와 혼합한 다음 젤(gel)의 각 홈에 검체를 조심스럽게 넣고 나머지 한 홈에 PCR 증폭산물의 크기를 식별하기에 적당한 표식 DNA(marker DNA) 7 μL를 넣는다. 1.5% 아가로스 젤(agarose gel) 상에서 100V로 전기영동한 후 Ethidium Bromide(EtBr) 염색액(10 mg/mL)으로 30분간 염색한 후 증류수로 10분간 탈색하고 자외선 조사기(UV transtilluminator)로 조사하여 증폭된 DNA 밴드를 관찰한다.

(4) 노로바이러스 유전자 증폭에 사용하는 프라이머는 표 5와 같다.

표 5. 노로바이러스 PCR 프라이머 염기서열

Genogroup	Primer	Sequence(5'→3')	Application
I	GI-F1M	CTG CCC GAA TTY GTA AAT GAT GAT	One-step RT PCR
	GI-R1M	CCA ACC CAR CCA TTR TAC ATY TG	One-step RT PCR/ Semi-nested PCR/ Sequencing
	GI-F2-U	AAT ACG ACT CAC TAT AGA TGA TGA TGG CGT CTA AGG ACG C	Semi-nested PCR/ Sequencing
II	GII-F1M	GGG AGG GCG ATC GCA ATC T	One-step RT PCR
	GII-R1M	CCR CCI GCA TRI CCR TTR TAC AT	One-step RT PCR
	GII-F3M	TTG TGA ATG AAG ATG GCG TCG ART	Semi-nested PCR/ Sequencing
	GII-R1M-U	GCG GAT AAC AAT TTC ACA CAG GCC RCC IGC ATR ICC RTT RTA CAT	Semi-nested PCR/ Sequencing

다) 1차 결과 확인

(1) 아가로스 젤(agarose gel)상에서 시료에 330 bp의 밴드가 있을 경우 GI 형 노로바이러스로, 332 bp의 밴드가 있을 경우 GII 형 노로바이러스로 일차 확인하되, 양성대조군 GI 형은 706 bp, GII형은 708 bp로 확인되어야 한다.

(2) 만일 음성대조군(negative control)이나 검체에서 양성대조군(positive control)과 같은 크기의 밴드가 확인되거나 또는 양성대조군에서 밴드가 확인이 되지 않을 경우 등은 재시험을 실시해야한다(표 6참고).

(3) 노로바이러스가 일차 확인된 경우 최종 확인을 위하여 아가로스 젤(agarose gel)상에서 해당부위를 절취하여 PCR 산물을 정제한 후 염기서열(DNA sequencing)을 분석하여 최종 판정한다.

표 6. 노로바이러스 PCR 결과판정(예시)

	추출 RNA(시료)	양성대조군	음성대조군	1차 판정
1	+	+	-	PCR 검출
	+
2	+	+	-	PCR 검출
	-
3	+	+	+	재 실험
	+
4	+	-	-	재 실험
	-
5	-	+	-	PCR 불검출
	-

+ : 노로바이러스 PCR 밴드 확인됨, - : 밴드가 확인되지 않음

라) 최종 검출 판정

(1) 염기서열 분석(DNA sequencing)을 위하여 다)의 (3)에서 정제된 DNA 1 μL를 주형으로 바이러스 유전형 및 진행방향에 따라 GI의 경우 GI-F2-U 및 GI-R1M, GII의 경우 GII-F3M 및 GII-R1M-U의 프라이머(primer)를 사용한다.

(2) 염기서열 분석(sequencing) 반응을 위한 혼합 조건은 각 유전자형 Semi-nested 프라이머(primer, 1 pmol)를 독립된 각각의 튜브에 2 μL, dye-terminator 2 μL, 정제 DNA 2 μL를 첨가하여 증류수로 최종 10 μL가 되도록 하고 96℃에서 1분간 DNA를 변성시킨 후, 96℃에서 10초간, 50℃에서 5초간, 60℃에서 4분간을 1회로 하여 25회 반응시킨 다음 60℃에서 10분간 연장반응을 시킨다.

(3) PCR 산물은 직접 염기서열 분석(DNA sequencing)하되 2종 이상의 유전자가 혼합되어 있는 경우에는 클로닝 염기서열 분석(Cloning DNA sequencing)을 재실시 한다. 염기서열 분석(DNA sequencing)에 의해 결정된 염기서열은 노로바이러스 유전자 데이터베이스(GI, GII Reference sequence 및 NCBI blast)와 비교하여 노로바이러스로 확인되었을 경우 검출된 것으로 최종 확인한다.

4.26 식중독균에 대한 분자생물학적 시험법

가. 살모넬라 시험법

1) 주형유전자 준비

증균 배양액(1～2 mL)을 취한 후, 원심분리 및 세척 단계를 거쳐 증류수에 현탁 후 10분간 끓여 원심분리하고, 상등액 10～20 μL를 취하여 시료로 사용한다.

※ 상기의 방법과 동등 이상인 유전자 추출키트 및 장비를 사용할 수 있다.

2) Real-time PCR 프라이머 및 프로브 염기서열

유전자	프라이머/프로브	염기서열(5‘→3’)
invA	Forward	5‘-GAA TCC TCA GTT TTT CAA CGT TTC-3’
	Reverse	5‘-CGA ATT GCC CGA ACG TGG CGA-3’
	Probe	5‘-FAM - CTC TTT CGT CTG GCA TTA TCG ATC AGT ACC AG - BHQ1-3’

3) Real-time PCR 반응액 조제

성분	최종농도	Stock용액 농도	1회 용량
Master Mix1)	1×	2×	10 μL
invA 프라이머(F)	500 nM	10 pmol/μL	1 μL
invA 프라이머(R)	500 nM	10 pmol/μL	1 μL
invA 프로브(P)	100 nM	2 pmol/μL	1 μL
주형 DNA	-	-	5 μL
증류수	-	-	2 μL
총량	-	-	20 μL

1) PowerAmpTM Real-time PCR Master Mix와 동등 이상의 시약을 사용할 수 있다.

4) Real-time PCR 반응조건

PCR 반응조건은 50℃에서 2분간 유지 및 95℃에서 10분간 방치하여 최초 변성이 일어나게 한 후, 95℃에서 15초간 변성시키고, 60℃에서 1분간 유전자 결합 및 신장반응이 일어나는 것을 1회로 하여 총 40회의 증폭반응을 한다.

구분	온도	시간	반응회수
	50℃	2분	1회
초기변성(Initial denaturation)	95℃	10분	1회
변성(denaturation)	95℃	15초	40회
결합(annealing)/신장(extension)	60℃	1분

* 상기 PCR 조건이 최적이 아닌 경우 변형하여 사용할 수 있다.

5) 결과 확인

(1) PCR 반응에서 증폭곡선이 확인되지 않는 경우 살모넬라 불검출로 판정할 수 있다. 다만, 음성대조군에서 증폭곡선이 확인되거나 양성대조군에서 증폭곡선이 확인되지 않을 경우 재시험하여야 한다.

(2) 증폭곡선이 확인되는 경우 분리배양 후 생화학적 검사 등을 통하여 살모넬라로 동정되면 검출로 판정한다.

나. 크로노박터 시험법

1) 주형유전자 준비

증균 배양액(1∼2 mL)을 취한 후, 원심분리 및 세척 단계를 거쳐 증류수에 현탁 후 10분간 끓여 원심분리하고, 상등액 10∼20 μL를 취하여 시료로 사용한다.

※ 상기의 방법과 동등 이상인 유전자 추출키트 및 장비를 사용할 수 있다.

2) Real-time PCR 프라이머 및 프로브 염기서열

프라이머/프로브	염기서열(5‘→3’)
Forward	5‘-GGG ATA TTG TCC CCT GAA ACA G-3’
Reverse	5‘-CGA GAA TAA GCC GCG CAT T-3’
Probe	5‘-FAM-AGA GTA GTA GTT GTA GAG GCC GTG CTT CCG AAA G-TAMRA-3’

3) Real-time PCR 반응액 조제

성분	최종농도	Stock용액 농도	1회 용량
Universal Master Mix	1×	2×	12.5 μL
프라이머(F)	900nM	10 pmol/μL	2.25 μL
프라이머(R)	900nM	10 pmol/μL	2.25 μL
프로브(P)	250nM	10 pmol/μL	0.625 μL
주형 DNA	-	-	5 μL
총량	-	-	25 μL

4) Real-time PCR 반응조건

구분	온도	시간	반응회수
초기변성(Initial denaturation)	95℃	3분	-
변성(denaturation)	95℃	15초	40회
결합(annealing)	52℃	20초
신장(extension)	72℃	30초

※ 상기 PCR 조건이 최적이 아닌 경우 변형하여 사용할 수 있다.

5) 결과 확인

PCR 반응에서 증폭곡선이 확인되는 경우 분리배양 후 생화학적 검사 등을 통하여 크로노박터로 동정되면 검출로 판정한다. 다만, 음성대조군에서 증폭곡선이 확인되거나 양성대조군에서 증폭곡선이 확인되지 않을 경우 재시험하여야 한다.

다. 장염비브리오 시험법

1) 제1법

(1) 주형 유전자 준비

증균 배양액(1∼2 mL)을 취한 후, 원심분리 및 세척 단계를 거쳐 증류수에 현탁 후 10분간 끓여 원심분리하고, 상등액 10∼20 μL를 취하여 시료로 사용한다.

※ 상기의 방법과 동등 이상인 유전자 추출키트 및 장비를 사용할 수 있다.

(2) Real-time PCR 프라이머 및 프로브 염기서열

Target gene	염기서열(5‘→3’)
toxR	Forward	GAA CCA GAA GCG CCA GTA GT
	Reverse	AAA CAG CAG TAC GCA AAT CG
	Probe	FAM-TCA CAG CAG AAG CCA CAG GTG C-TAMRA

(3) Real-time PCR 반응액 조제

성분	최종농도	Stock용액 농도	1회 용량
Master Mix	1x	2x	12.5 μL
toxR 프라이머(F)	100 nM	10 pmol/μL	0.25 μL
toxR 프라이머(R)	100 nM	10 pmol/μL	0.25 μL
toxR 프로브(P)	500 nM	10 pmol/μL	1.25 μL
주형 DNA	-	-	5 μL
증류수	-	-	5.75 μL
총량	-	-	25 μL

(4) Real-time PCR 반응조건

구분	온도	시간	반응회수
초기변성(Initial denaturation)	95℃	10분	-
변성(Denaturation)	95℃	15초	45
결합(Annealing)	60℃	1분

※ 상기 Real-time PCR 반응액 조성 및 조건이 최적이 아닌 경우 변형하여 사용할 수 있다.

(5) 결과 확인

(가) PCR 반응에서 증폭곡선이 확인되지 않는 경우 장염비브리오 불검출로 판정할 수 있다. 다만, 음성대조군에서 증폭곡선이 확인되거나 양성대조군에서 증폭곡선이 확인되지 않을 경우 재시험하여야 한다.

(나) 증폭곡선이 확인되는 경우 분리배양 후 생화학적 검사 등을 통하여 장염비브리오로 동정되면 검출로 판정한다.

2) 제2법

(1) 주형 유전자 준비

상기 제1법의 (1) 주형 유전자 준비에 따른다.

(2) PCR 프라이머 염기서열

Target gene	염기서열(5‘→3’)		Size (bp)
toxR	Forward	GTC TTC TGA CGC AAT CGT TG	368
	Reverse	ATA CGA GTG GTT GCT GTC ATG

(3) PCR 반응액 조제

성분	최종농도	Stock용액 농도	1회 용량
완충액	1×	10×	5 μL
MgCl2	2.5 mM	20 mM	6.25 μL
dNTPs	0.25 mM	10 mM	1.25 μL
toxR 프라이머(F)	1μM	10 pmol/μL	5 μL
toxR 프라이머(R)	1μM	10 pmol/μL	5 μL
Taq	1.25 U/tube	5 U/μL	0.25 μL
주형 DNA	-	-	2.5 μL
증류수	-	-	24.75 μL
총량	-	-	50 μL

(4) PCR 반응조건

구분	온도	시간	반응회수
초기변성(Initial denaturation)	96℃	5분	1
변성(Denaturation)	94℃	1분	30
결합(Annealing)	63℃	1분 30초
신장(Extension)	72℃	1분 30초
최종신장(Final extension)	72℃	7분	1

※ 상기 PCR 반응액 조성 및 조건은 필요하다면 적절하게 변형하여 사용할 수 있다. 다만 변형된 PCR 반응액 조성 및 조건은 사전에 반드시 검증되어야 한다.

(5) 결과 확인

최종산물의 반응액 5 μL를 취하여 2% agarose gel로 100 V에서 25분간 전기영동하고 에티디움 브로마이드(EtBr)(1 μL/mL) 또는 동등한 기능의 염색시약으로 염색한 후 UV를 이용하여 반응생성물을 확인한다. 이때, DNA 크기를 알 수 있도록 100 bp ladder를 동시에 전기영동 한다. toxR 유전자(368 bp)의 반응생성물이 확인되는 경우 toxR 유전자가 확인된 것으로 판정한다.

라. 리스테리아 모노사이토제네스 시험법

1) 제1법

(1) 주형 유전자 준비

증균 배양액(1～2 mL)을 취한 후, 원심분리 및 세척 단계를 거쳐 증류수에 현탁 후 10분간 끓여 원심분리하고, 상등액 10∼20 μL를 취하여 시료로 사용한다.

※ 상기의 방법과 동등 이상인 유전자 추출키트 및 장비를 사용할 수 있다.

(2) Real-time PCR 프라이머 염기서열

Target gene	염기서열(5‘→3’)
iap	Forward	CTA AAG CGG GAA TCT CCC TT
	Reverse	CCA TTG TCT TGC GCG TTA AT
	Probe	FAM-CCT CTG GCG CAC AAT ACG CTA GCA CT- TAMRA

(3) Real-time PCR 반응액 조제

성분	최종농도	Stock용액 농도	1회 용량
Master Mix	1×	2×	12.5 μL
iap 프라이머(F)	300 nM	10 pmole/μL	0.75 μL
iap 프라이머(R)	300 nM	10 pmole/μL	0.75 μL
iap 프로브(P)	300 nM	10 pmole/μL	0.75 μL
증류수	-	-	5.25 μL
주형 DNA	-	-	5 μL
총량	-	-	25 μL

(4) Real-time PCR 반응조건

구분	온도	시간	반응회수
초기변성(Initial denaturation)	50℃	2분	-
	95℃	10분	-
변성(Denaturation)	95℃	15초	40
결합(Annealing)	60℃	1분

※ 상기 Real-time PCR 반응액 조성 및 조건이 최적이 아닌 경우 변형하여 사용할 수 있다.

(5) 결과 확인

(가) PCR 반응에서 증폭곡선이 확인되지 않는 경우 리스테리아 모노사이토제네스 불검출로 판정할 수 있다. 다만, 음성대조군에서 증폭곡선이 확인되거나 양성대조군에서 증폭곡선이 확인되지 않을 경우 재시험하여야 한다.

(나) 증폭곡선이 확인되는 경우 분리배양 후 생화학적 검사 등을 통하여 리스테리아 모노사이토제네스로 동정되면 검출로 판정한다.

2) 제2법

(1) 주형 유전자 준비

상기 제1법의 (1) 주형유전자 준비에 따른다.

(2) PCR 프라이머 염기서열

Target gene	염기서열(5‘→3’)		Size (bp)
hlyA	Forward	CAT TAG TGG AAA GAT GGA ATG	730
	Reverse	GTA TCC TCC AGA GTG ATC GA

(3) PCR 반응액 조제

성분	최종농도	Stock용액 농도	1회 용량
완충액	1×	10×	5 μL
dNTPs	0.8 mM	10 mM	4 μL
MgCl2	2 mM	20 mM	5 μL
hlyA 프라이머 (F)	10 pmol	10 pmol/μL	1 μL
hlyA 프라이머 (R)	10 pmol	10 pmol/μL	1 μL
주형 DNA	5 μL	-	5 μL
Taq polymerase	0.5 U	0.5 U/μL	1 μL
증류수	-	-	28 μL
총량	-	-	50 μL

*Taq polymerase는 PCR 초기변성 반응 후 첨가한다.

(4) PCR 반응조건

구분	온도 (℃)	시간	반응회수
초기변성	80	10 분	1
	94	5 분	1
0.5 U/μL Taq Polymerase 첨가
변성	94	3 분	1
변성	94	1 분	30
결합	55	1 분
신장	72	2 분
최종신장	72	2 분	1

※ 상기 PCR 반응액 조성 및 조건은 적절하게 변형하여 사용할 수 있다.

(5) 결과 확인

최종산물의 반응액 5 μL를 취하여 1.2% agarose gel로 100V에서 25분간 전기영동하고 에티디움 브로마이드(EtBr)(1 μL/mL) 또는 동등한 기능의 염색시약으로 염색한 후 UV를 이용하여 반응생성물을 확인한다. 이때, DNA 크기를 알 수 있도록 100 bp ladder를 동시에 전기영동 한다. hlyA 유전자(730 bp)의 반응생성물이 확인되는 경우 hlyA 유전자가 확인된 것으로 판정한다.

마. 캠필로박터 제주니/콜리 시험법

1) 주형 유전자 준비

증균배양액(1-2 mL)을 취한 후, 원심분리 및 세척 단계를 거쳐 증류수에 현탁 후 10분간 끓여 원심분리하고, 상등액 10∼20 μL를 취하여 시료로 사용한다.

※ 상기의 방법과 동등 이상인 유전자 추출키트 및 장비를 사용할 수 있다.

2) Real-time PCR 프라이머 염기서열

Target gene	프라이머/프로브	염기서열(5‘→3’)	size (bp)
mapA (캠필로박터 제주니)	Forward	CTG GTG GTT TTG AAG CAA AGA TT	-
	Reverse	CAA TAC CAG TGT CTA AAG TGC GTT TAT
	Probe	FAM-TTG AAT TCC AAC ATC GCT AAT GTA TAA AAG CCC TTT - TAMRA
ceuE (캠필로박터 콜리)	Forward	AAG CTC TTA TTG TTC TAA CCA ATT CTA ACA	-
	Reverse	TCA TCC ACA GCA TTG ATT CCT AA
	Probe	VIC-TTG GAC CTC AAT CTC GCT TTG GAA TCA TT-TAMRA

3) Real-time PCR 반응액 조제

성분	최종농도	Stock용액 농도	1회 용량
Taqman Universal Master Mix	1×	2×	12.5 μL
프라이머(F)	300 nM	10 pmole/μL	0.75 μL
프라이머(R)	300 nM	10 pmole/μL	0.75 μL
프로브(P)	250 nM	10 pmole/μL	0.625 μL
주형 DNA	-	-	5 μL
증류수			5.375 μL
총량	-	-	25 μL

4) Real-time PCR 반응조건

구분	온도	시간	반응회수
초기변성(initial denaturation)	50℃	2분	-
	95℃	10분	-
변성(denaturation)	95℃	15초	40
결합(annealing)	60℃	1분

※ 상기 Real-time PCR 반응액 조성 및 조건은 적절하게 변형하여 사용할 수 있다.

5) 결과 확인

(1) PCR 반응에서 증폭곡선이 확인되지 않는 경우 캠필로박터 제주니/콜리 불검출로 판정할 수 있다. 다만, 음성대조군에서 증폭곡선이 확인되거나 양성대조군에서 증폭곡선이 확인되지 않을 경우 재시험하여야 한다.

(2) 증폭곡선이 확인되는 경우 분리배양 후 생화학적 검사 등을 통하여 캠필로박터 제주니/콜리로 동정되면 검출로 판정한다.

바. 클로스트리디움 보툴리눔 독소유전자 시험법

1) 주형 유전자 준비

전형적인 집락을 취하여 멸균증류수 100 μL에 현탁한 후, 15분간 끓여 원심분리하고, 상층액 10 μL를 취하여 시료로 사용한다.

※ 상기의 방법과 동등 이상인 유전자 추출키트 및 장비를 사용할 수 있다.

2) PCR 프라이머 염기서열

Toxin type	프라이머	염기서열(5‘→3’)	Size (bp)
A	Forward	AGC TAC GGA GGC AGC TAT GTT	782
	Reverse	CGT ATT TGG AAA GCT GAA AAG G
B	Forward	CAG GAG AAG TGG AGC GAA AA	205
	Reverse	CTT GCG CCT TTG TTT TCT TG
E	Forward	CCA AGA TTT TCA TCC GCC TA	389
	Reverse	GCT ATT GAT CCA AAA CGG TGA
F	Forward	CGG CTT CAT TAG AGA ACG GA	543
	Reverse	TAA CTC CCC TAG CCC CGT AT

3) PCR 반응액 조제

성분	최종농도	Stock용액 농도	1회 용량
완충액	1×	10×	5 μL
MgCl2	2.5 mM	25 mM	5 uL
dNTPs	0.2 mM	2.5 mM	4 μL
프라이머(F)	0.3 μM	10 pmol/μL	1.5 μL
프라이머(R)	0.3 μM	10 pmol/μL	1.5 μL
주형 DNA	-	-	1 μL
Taq	2 U/tube	5 U/μL	0.4 μL
증류수	-	-	31.6 uL
총량	-	-	50 μL

4) PCR 반응조건

구분	온도	시간	반응회수
변성(denaturation)	95℃	30초	27회
결합(annealing)	60℃	25초
신장(extension)	72℃	1분25초
최종신장(final extension)	72℃	3분

※ 상기 PCR 조건이 최적이 아닌 경우 변형하여 사용할 수 있다.

5) 결과 확인

PCR 반응에서 각각의 보툴리눔 독소 타입별 증폭산물이 확인되는 경우 클로스트리디움 보툴리눔 독소유전자가 확인된 것으로 판정한다.

사. 클로스트리디움 퍼프린젠스 시험법

1) 제1법

(1) 주형 유전자 준비

증균 배양액(1～2 mL)을 취한 후, 원심분리 및 세척 단계를 거쳐 증류수에 현탁 후 10분간 끓여 원심분리하고, 상등액 10∼20 μL를 취하여 시료로 사용한다.

※ 상기의 방법과 동등 이상인 유전자 추출키트 및 장비를 사용할 수 있다.

(2) Real-time PCR 프라이머 및 프로브 염기서열

Target gene	프라이머 /프로브	염기서열(5‘→3’)
cpa	Forward	GTA GCT TAC ATA TCA ACT AGT GGT GA
	Reverse	CAT TTC CTG GGT TGT CCA TTT C
	Probe	FAM-AAA GAT GCT GGA ACA GAT GAC TAC ATG-TAMRA

(3) Real-time PCR 반응액 조제

성분	최종농도	Stock용액 농도	1회 용량
Master Mix	1×	2×	12.5 μL
cpa 프라이머(F)	250 nM	2.5 pmol/μL	2.5 μL
cpa 프라이머(R)	250 nM	2.5 pmol/μL	2.5 μL
cpa 프로브(P)	100 nM	1.0 pmol/μL	2.5 μL
주형 DNA	-	-	5 μL
총량	-	-	25 μL

(4) Real-time PCR 반응조건

구분	온도	시간	반응회수
초기변성(Initial denaturation)	50℃	2분	11)
	95℃	10분	1
변성(Denaturation)	95℃	15초	40
결합(Annealing)	60℃	1분

1) 반응액 중 UNG(UTP-N-glycosylase)를 함유한 경우에 한함

※ 상기 PCR 반응액 조성 및 조건은 필요하다면 적절하게 변형하여 사용할 수 있다. 다만 변형된 PCR 반응액 조성 및 조건은 사전에 반드시 검증되어야 한다.

(5) 결과 확인

(가) PCR 반응에서 증폭곡선이 확인되지 않는 경우 클로스트리디움  퍼프린젠스 불검출로 판정할 수 있다. 다만, 음성대조군에서 증폭곡선이 확인되거나 양성대조군에서 증폭곡선이 확인되지 않을 경우 재시험하여야 한다.

(나) 증폭곡선이 확인되는 경우 분리배양 후 생화학적 검사 등을 통하여 클로스트리디움 퍼프린젠스로 동정되면 검출로 판정한다.

2) 제2법

(1) 주형 유전자 준비

상기 제1법의 (1) 주형 유전자 준비에 따른다.

(2) PCR 프라이머 염기서열

Target gene	프라이머	염기서열(5‘→3’)	Size (bp)
cpa	Forward	TGC TAA TGT TAC TGC CGT TGA TAG	247
	Reverse	ATA ATC CCA ATC ATC CCA ACT ATG

(3) PCR 반응액 조제

성분	최종농도	Stock용액 농도	1회 용량
완충액	1×	10×	5 μL
MgCl2	2 mM	20 mM	5 μL
dNTPs	0.2 mM	10 mM	1 μL
cpa 프라이머(F)	1 μM	10 pmol/μL	5 μL
cpa 프라이머(R)	1 μM	10 pmol/μL	5 μL
Taq	2.5 U/tube	5 U/μL	0.5 μL
주형 DNA	-	-	5 μL
증류수		-	23.5 μL
총량	-	-	50 μL

(4) PCR 반응조건

구분	온도	시간	반응회수
초기변성(Initial denaturation)	95℃	5분	1
변성(Denaturation)	95℃	30초	30
결합(Annealing)	50℃	30초
신장(Extension)	72℃	30초
최종 신장(Final extension)	72℃	10분	1

※ 상기 PCR 반응액 조성 및 조건은 필요하다면 적절하게 변형하여 사용할 수 있다. 다만 변형된 PCR 반응액 조성 및 조건은 사전에 반드시 검증되어야 한다.

(5) 결과 확인

최종산물의 반응액 5 μL를 취하여 2% agarose gel로 100 V에서 25분간 전기영동하고 에티디움브로마이드(EtBr)(1 μL/mL) 또는 동등한 기능의 염색시약으로 염색한 후 UV를 이용하여 반응생성물을 확인한다. 이때, DNA 크기를 알 수 있도록 100 bp ladder를 동시에 전기영동 한다. cpa 유전자(247 bp)의 반응생성물이 확인되는 경우 cpa 유전자가 확인된 것으로 판정한다.

아. 황색포도상구균 시험법

1) 제1법

(1) 주형 유전자 준비

증균 배양액(1～2 mL)을 취한 후, 원심분리 및 세척 단계를 거쳐 증류수에 현탁 후 10분간 끓여 원심분리하고, 상등액 10∼20 μL를 취하여 시료로 사용한다.

※ 상기의 방법과 동등 이상인 유전자 추출키트 및 장비를 사용할 수 있다.

(2) Real-time PCR 프라이머 및 프로브 염기서열

Target gene	프라이머 /프로브	염기서열(5‘→3’)
femA	Forward	AAT AAT AAC GAG GTC ATT GCA GCT T
	Reverse	TGG ACC GCG ATT TGA ATA AAA
	Probe	FAM-CTT ACT TAC TGC TGT ACC TGT T-MGB

(3) Real-time PCR 반응액 조제

성분	최종농도	Stock용액 농도	1회 용량
Master Mix	1×	2×	12.5 μL
femA 프라이머(F)	900 nM	9 pmol/μL	2.5 μL
femA 프라이머(R)	900 nM	9 pmol/μL	2.5 μL
femA 프로브(P)	250 nM	2.5 pmol/μL	2.5 μL
주형 DNA	-	-	5 μL
총량	-	-	25 μL

(4) Real-time PCR 반응조건

구분	온도	시간	반응회수
초기변성(Initial denaturation)	50℃	2분	11)
	95℃	10분	1
변성(Denaturation)	95℃	15초	40
결합(Annealing)	60℃	1분

1) 반응액 중 UNG(UTP-N-glycosylase)를 함유한 경우에 한함

※ 상기 PCR 반응액 조성 및 조건은 필요하다면 적절하게 변형하여 사용할 수 있다. 다만 변형된 PCR 반응액 조성 및 조건은 사전에 반드시 검증되어야 한다.

(5) 결과 확인

(가) PCR 반응에서 증폭곡선이 확인되지 않는 경우 황색포도상구균 불검출로 판정할 수 있다. 다만, 음성대조군에서 증폭곡선이 확인되거나 양성대조군에서 증폭곡선이 확인되지 않을 경우 재시험하여야 한다.

(나) 증폭곡선이 확인되는 경우 분리배양 후 생화학적 검사 등을 통하여 황색포도상구균으로 동정되면 검출로 판정한다.

2) 제2법

(1) 주형 유전자 준비

상기 제1법의 (1) 주형 유전자 준비에 따른다.

(2) PCR 프라이머 염기서열

Target gene	프라이머	염기서열(5‘→3’)	Size (bp)
femA	Forward	AAT AAT AAC GAG GTC ATT GCA GCT T	87
	Reverse	TGG ACC GCG ATT TGA ATA AAA

(3) PCR 반응액 조제

성분	최종농도	Stock용액 농도	1회 용량
완충액	1×	10×	5 μL
MgCl2	1.5 mM	20 mM	3.75 μL
dNTPs	0.3 mM	10 mM	1.5 μL
femA 프라이머(F)	1 μM	10 pmol/μL	5 μL
femA 프라이머(R)	1 μM	10 pmol/μL	5 μL
Taq	2 U/tube	5 U/μL	0.4 μL
주형 DNA	-	-	5 μL
증류수	-	-	24.35 μL
총량	-	-	50 μL

(4) PCR 반응조건

구분	온도	시간	반응회수
초기변성(Initial denaturation)	95℃	10분	1
변성(Denaturation)	95℃	20초	30
결합(Annealing)	60℃	30초
신장(Extension)	72℃	10초
최종 신장(Final extension)	72℃	3분	1

※ 상기 PCR 반응액 조성 및 조건은 필요하다면 적절하게 변형하여 사용할 수 있다. 다만 변형된 PCR 반응액 조성 및 조건은 사전에 반드시 검증되어야 한다.

(5) 결과 확인

최종산물의 반응액 5 μL를 취하여 2.0% agarose gel로 100 V에서 25분간 전기영동하고 에티디움브로마이드(EtBr)(1 μL/mL) 또는 동등한 기능의 염색시약으로 염색한 후 UV를 이용하여 반응생성물을 확인한다. 이때, DNA 크기를 알 수 있도록 50 bp ladder를 동시에 전기영동 한다. femA 유전자(87 bp)의 반응생성물이 확인되는 경우 femA 유전자가 확인된 것으로 판정한다.

자. 비브리오 패혈증균 시험법

1) 제1법

(1) 주형 유전자 준비

증균 배양액(1～2 mL)을 취한 후, 원심분리 및 세척 단계를 거쳐 증류수에 현탁 후 10분간 끓여 원심분리하고, 상등액 10∼20 μL를 취하여 시료로 사용한다.

※ 상기의 방법과 동등 이상인 유전자 추출키트 및 장비를 사용할 수 있다.

(2) Real-time PCR 프라이머 및 프로브 염기서열

Target gene	프라이머 /프로브	염기서열(5‘→3’)
glnA	Forward	CTT GCA GAC ACC GTT CTA GTT
	Reverse	GCG TAG GTC TTG TGA AGA AT
	Probe	FAM-CAG GCG TGA AGG GTG GTT ACT TCC-TAMRA

(3) Real-time PCR 반응액 조제

성분	최종농도	Stock용액 농도	1회 용량
Master Mix	1×	2×	12.5 μL
glnA 프라이머 (F)	250 nM	6.25 pmol/μL	1 μL
glnA 프라이머 (R)	250 nM	6.25 pmol/μL	1 μL
프로브 (P)	200 nM	5 pmol/μL	1 μL
주형 DNA	-	-	5 μL
증류수			4.5 μL
총량	-	-	25 μL

(4) Real-time PCR 반응조건

구분	온도	시간	반응회수
초기변성(Initial denaturation)	50℃	2분	11)
	95℃	10분	1
변성(Denaturation)	95℃	15초	45
결합(Annealing)	60℃	1분

1) 반응액 중 UNG(UTP-N-glycosylase)를 함유한 경우에 한함

※ 상기 PCR 반응액 조성 및 조건은 필요하다면 적절하게 변형하여 사용할 수 있다. 다만 변형된 PCR 반응액 조성 및 조건은 사전에 반드시 검증되어야 한다.

(5) 결과 확인

(가) PCR 반응에서 증폭곡선이 확인되지 않는 경우 비브리오 패혈증균 불검출로 판정할 수 있다. 다만, 음성대조군에서 증폭곡선이 확인되거나 양성대조군에서 증폭곡선이 확인되지 않을 경우 재시험하여야 한다.

(나) 증폭곡선이 확인되는 경우 분리배양 후 생화학적 검사 등을 통하여 비브리오 패혈증균으로 동정되면 검출로 판정한다.

2) 제2법

(1) 주형 유전자 준비

상기 제1법의 (1) 주형 유전자 준비에 따른다.

(2) PCR 프라이머 염기서열

Target gene	프라이머	염기서열(5‘→3’)	Size (bp)
glnA	Forward	CTT GCA GAC ACC GTT CTA GTT	218
	Reverse	GCG TAG GTC TTG TGA AGA AT

(3) PCR 반응액 조제

성분	최종농도	Stock용액 농도	1회 용량
완충액	1×	10×	5 μL
MgCl2	2.0 mM	20 mM	5 μL
dNTPs	0.25 mM	10 mM	1.25 μL
glnA 프라이머(F)	1 μM	10 pmol/μL	5 μL
glnA 프라이머(R)	1 μM	10 pmol/μL	5 μL
Taq	1.0 U/tube	5 U/μL	0.2 μL
주형 DNA	-	-	5 μL
증류수	-	-	23.55 μL
총량	-	-	50 μL

(4) PCR 반응조건

구분	온도	시간	반응회수
초기변성(Initial denaturation)	95℃	5분	1
변성(Denaturation)	95℃	30초	25
결합(Annealing)	55℃	30초
신장(Extension)	72℃	30초
최종 신장(Final extension)	72℃	5분	1

※ 상기 PCR 반응액 조성 및 조건은 필요하다면 적절하게 변형하여 사용할 수 있다. 다만 변형된 PCR 반응액 조성 및 조건은 사전에 반드시 검증되어야 한다.

(5) 결과 확인

최종산물의 반응액 5 μL를 취하여 2.0% agarose gel로 100 V에서 25분간 전기영동하고 에티디움브로마이드(EtBr)(1 μL/mL) 또는 동등한 기능의 염색시약으로 염색한 후 UV를 이용하여 반응생성물을 확인한다. 이때, DNA 크기를 알 수 있도록 100 bp ladder를 동시에 전기영동 한다. glnA 유전자(218 bp)의 반응생성물이 확인되는 경우 glnA 유전자가 확인된 것으로 판정한다.

차. 비브리오 콜레라 시험법

1) 주형 유전자 준비

증균 배양액(1～2 mL)을 취한 후, 원심분리 및 세척 단계를 거쳐 증류수에 현탁 후 10분간 끓여 원심분리하고, 상등액 10∼20 μL를 취하여 시료로 사용한다.

※ 상기의 방법과 동등 이상인 유전자 추출키트 및 장비를 사용할 수 있다.

2) PCR 프라이머 염기서열

Target gene	프라이머	염기서열(5‘→3’)	Size (bp)
prVC	Forward	TTA AGC STT TTC RCT GAG AAT G	295-310
	Reverse	AGT CAC TTA ACC ATA CAA CCC G

3) PCR 반응액 조제

성분	최종농도	Stock용액 농도	1회 용량
완충액	1×	10×	5 μL
MgCl2	2.5 mM	20 mM	6.25 μL
dNTPs	0.25 mM	10 mM	1.25 μL
prVC 프라이머(F)	1 μM	10 pmol/μL	5 μL
prVC 프라이머(R)	1 μM	10 pmol/μL	5 μL
Taq	1.25 U/tube	5 U/μL	0.25 μL
주형 DNA	-	-	2.5 μL
증류수	-	-	24.75 μL
총량	-	-	50 μL

4) PCR 반응조건

구분	온도	시간	반응회수
초기변성(Initial denaturation)	94℃	2분	1
변성(Denaturation)	94℃	1분	30
결합(Annealing)	50℃	1분
신장(Extension)	72℃	1분 30초
최종 신장(Final extension)	72℃	10분	1

※ 상기 PCR 반응액 조성 및 조건은 필요하다면 적절하게 변형하여 사용할 수 있다. 다만 변형된 PCR 반응액 조성 및 조건은 사전에 반드시 검증되어야 한다.

5) 결과 확인

최종산물의 반응액 5 μL를 취하여 2.0% agarose gel로 100 V에서 25분간 전기영동하고 에티디움브로마이드(EtBr)(1 μL/mL) 또는 동등한 기능의 염색시약으로 염색한 후 UV를 이용하여 반응생성물을 확인한다. 이때, DNA 크기를 알 수 있도록 100 bp ladder를 동시에 전기영동 한다. prVC 유전자(295∼310 bp)의 반응생성물이 확인되는 경우 prVC 유전자가 확인된 것으로 판정한다.

4.27. 비브리오 패혈증균(Vibrio vulnificus)

가. 증균배양

검체 25 g 또는 25 mL를 취하여 225 mL의 Alkaline 펩톤수(배지 16)를 가한 후 35∼37℃에서 18∼24시간 증균배양한다.

나. 분리배양

증균배양액을 TCBS 한천배지(배지 17)와 mCPC 한천배지(배지 101(신설))에 각각 접종하여 35～37℃에서 18∼24시간 배양한다. 배양 결과 비브리오 패혈증균은 TCBS 한천배지에서 청록색의 sucrose 비분해 집락, mCPC 한천배지에서 노란색 집락에 대하여 확인시험을 실시한다.

다. 확인시험

분리배양된 평판배지상의 집락을 LIM 반유동배지(배지 18), 2% NaCl을 첨가한 보통한천배지(배지 8)에 각각 접종한 후 35∼37℃에서 18∼24시간 배양한다. 비브리오 패혈증균은 그람음성의 무아포간균으로 LIM배지에서 Lysine Decarboxylase 양성, Indole 생성, 운동성 양성, Oxidase시험 양성이다. 비브리오 패혈증균으로 추정된 균은 0, 6 및 10% NaCl을 포함한 Alkaline 펩톤수(배지 16)에 의한 내염성시험, Arginine 분해시험(배지 21, 1% Arginine 첨가), ONPG(배지22)시험을 실시한다. 비브리오 패혈증균은 0% 및 10% NaCl을 포함한 배지에서 발육 음성, 6% NaCl을 포함한 배지에서는 발육 양성, Arginine 분해 음성, ONPG 시험 양성이다.

4.28. 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)

가. 증균배양

신선 수산물 검체 25 g 또는 25 mL를 취하여 225 mL의 Alkaline 펩톤수(배지 16)를 가한 후 35∼37℃에서 6∼8시간 증균배양한다. 그 외 냉동 등 가공처리된 검체의 경우 18∼24시간 증균배양한다.

나. 분리배양

증균배양액을 TCBS 한천배지(배지 17)와 mCPC 한천배지(배지 101(신설))에 각각 접종하여 35∼37℃에서 18∼24시간 배양한다. 배양 결과 비브리오 콜레라는 TCBS 한천배지에서 노란색의 sucrose 분해 집락, mCPC 한천배지에서 녹색∼자주색 집락에 대하여 확인시험을 실시한다.

다. 확인시험

분리배양된 평판배지상의 집락을 LIM 반유동배지(배지 18), 2% NaCl을 첨가한 보통한천배지(배지 8)에 각각 접종한 후 35~37℃에서 18∼24시간 배양한다. 비브리오 콜레라는 그람음성의 무아포간균으로 LIM배지에서 Lysine Decarboxylase 양성, Indole 생성, 운동성 양성, Oxidase시험 양성이다. 비브리오 콜레라로 추정된 균은 0, 6 및 10% NaCl을 포함한 Alkaline 펩톤수(배지 16)에 의한 내염성시험, Arginine 분해시험(배지 21, 1% Arginine첨가), ONPG(배지22)시험을 실시한다. 비브리오 콜레라는 0% NaCl 배지에서 발육 양성, 6% 및 10% NaCl을 포함한 배지에서는 발육 음성, Arginine 분해 음성, ONPG 시험 양성이다. 필요한 경우 비브리오 콜레라 진단용 항혈청을 사용한 응집반응 결과에 따라 O1, O139 혈청형을 확인한다.